异花授粉调控梨石细胞木质素合成的分子机理

石细胞是影响梨品质的关键因素之一，木质素关键合成酶基因表达将影响木质素单体聚合程度和方式，导致石细胞团的大小、数目和密度不同。本项目拟以石细胞含量及石细胞团大小不同的砂梨系、白梨系、洋梨系、秋子梨系品种，及已构建的不同亲缘关系授粉组合的砀山酥梨为材料，克隆木质素合成途径中与木质素单体聚合有关的关键合成酶基因(CCR、CCoAOMT、CAD、COMT 和F5H 等)，从基因表达水平比较木质素单体、S/G-木质素表达差异，研究木质素关键合成酶基因表达特性与木质素单体聚合程度、石细胞团大小的关系；采用组织化学方法分析石细胞发育过程中木质素单体分布位点和沉积规律，结合HPLC、光谱和质谱技术方法，研究石细胞发育过程木质素结构类型变化规律；以期解析调控梨石细胞木质素合成途径中的关键合成酶基因功能，明确木质素单体聚合方式、结构类型与石细胞团形成的关系，从分子水平上揭示梨石细胞形成的原因和调控机理。

异花授粉显著影响梨果实石细胞发育，本项目建立了一种利用分子标记筛选砀山酥梨适宜授粉树的方法，初步阐明授粉影响梨果实石细胞发育的可能机理：是通过木质素代谢途径中关键酶基因调控木质素单体合成，改变木质素单体G/S比，从而影响木质素聚合、沉积及石细胞团形成，进而影响梨果实品质。主要取得下列结果：1、通过SCoT等分子标记发现，43个梨授粉材料遗传相似性系数为0.517～0.931，在遗传相似系数为0.690水平上，43份梨材料分为A和B两组；在遗传相似系数为0.746的水平上，A组又分为6个亚组。亲缘关系较远的华山、圆黄等对砀山酥梨授粉，果实石细胞含量少、石细胞团小，品质较好。2、显微、超显微观察表明，不同品种对砀山酥梨授粉后果实石细胞发育过程基本一致，但木质素在次生壁沉积的致密性存在显著差异。鸭梨、圆黄对砀山酥梨授粉果实木质素是G-S-木质素，木质素官能团和键型组成基本相同，以醇羟基为主(55%-90%)，酚羟基相对较少(10%-45%)，木质素结构单元连接键主要有β-O-4、β-1、β-5和β-β等；砀山酥梨×鸭梨石细胞含量高峰期在花后47d和71d，砀山酥梨×圆黄的只出现在花后47d；木质素含量、G/S也是先上升后下降；花后47d、63d，砀山酥梨×鸭梨G/S＜砀山酥梨×圆黄G/S。3、授粉调控砀山酥梨石细胞形成可能是通过花粉直感现象影响梨果实miRNAs表达，调控其对应靶基因，如木质素代谢相关的PbF5H、Pbr018935.1和 Pbr003857.1等，引起木质素单体偶联聚合反应，改变木质素单体组成及连接键型，木质素在薄壁细胞次生壁上沉积不同，进而改变次生壁壁层致密性；由于次生壁壁层致密性差异，导致石细胞团在果实发育后期抵抗薄壁细胞膨胀压及各种酶降解能力不同，导致不同品种对砀山酥梨授粉果实石细胞团大小不同，影响梨果实品质。4、鸭梨、圆黄对砀山酥梨授粉果实高通量测序，共有168种新miRNAs和617种已知miRNAs被检测到，68种miRNAs在两样本中表达量差异显著。克隆了梨果实木质素关键合成酶基因C4H、F5H、SAD、CAD、COMT、CAD2、CAD3、4CL、C3H和GT3等，并在NCBI上登陆。以上基因均已构建相应的原核、真核表达载体，正在进行蛋白纯化及相应拟南芥突变体遗传转化研究；已获得转PbF5H砀山酥梨阳性苗，目前微嫁接苗正在炼苗移栽。