活化素受体样激酶5在Tenon's囊成纤维细胞表型转化中的调控作用

青光眼滤过术后滤过道瘢痕化是致手术失败的重要原因，其机制尚不清楚，结膜下Tenon's囊成纤维细胞（HTF）表型转化是其重要的细胞学基础，干预HTF表型转化是防治滤过道瘢痕化的新策略。本项目前期研究发现活化素受体样激酶5（ALK5）抑制剂可以通过干预细胞信号转导通路（Smad与非Smad信号通路），下调结缔组织生长因子（CTGF）表达，抑制TGF-β诱导的HTF细胞表型转化。基于此提出ALK5是调控TGF-β表型转化的关键，但调控机制尚待研究。为证实此假设，本项目建立了受四环素及其衍生物诱导表达ALK5的HTF-Tet-On细胞，拟通过调控ALK5表达，观察CTGF及相关信号通路（Smad、MAPK、AKT信号通路）变化, 分别从各环节（信号通路抑制剂-信号通路蛋白的siRNA干扰-转录因子调控）阻断信号通路，探求可能存在的共同位点，阐明其下游信号通路，寻找出新的特异性抗纤维化的治疗靶点。

研究活化素受体样激酶 5（activin receptor-like kinase 5， ALK5）表达的调控作用。.结果： 1.TGF-β1 诱导 HTF 后，ALK5 的 mRNA 表达有所上调，于12-24h 达到高峰值。Western Blot显示蛋白表达水平也有所升高，于 24-36h 达到高峰值。细胞免疫荧光染色检测也同样显示，ALK5 表达水平升高。 2.实验成功构建了过表达 ALK5 基因的慢病毒载体，并获得了较高滴度的病毒液。采用慢病毒转染 HTF 细胞后，观察发现细胞增殖速度明显增加，并伴有凋亡现象，加入 SB-431542 后细胞生长速度及凋亡现象均有所逆转。MTT实验显示，转染 GFP 病毒的细胞与未转染的HTF细胞增值速度无明显变化，转染 ALK5 病毒的 HTF 细胞，增殖速度明显增加，而在培液中加入 SB-431542后，细胞增殖速度明显降低。转染后，过表达 ALK5 的细胞，表达 α-SMA 以及 FN蛋白水平有所下降，而加入 ALK5 抑制剂 SB-431542后，该过程可被抑制。 3.兔滤过性术后组织学观察显示：术后滤过道周围早期以水肿及炎症细胞为主，之后逐渐出现较多增殖的成纤维细胞，晚期成纤维细胞数量减少，胶原纤维沉积增多，产生瘢痕组织。ALK5 在结膜下成纤维细胞的表达在术后 3 天并不明显，到第7天开始逐渐增多，14 天时结膜下有大量表达，至 28 天，表达量有所下降，但仍高于术前。转染 ALK5 的实验眼，可以见到结膜下阳性的转染细胞，周围伴有大量的成纤维细胞增生。加入抑制剂后，术眼滤过道周围细胞增殖和瘢痕组织均有所减少，结膜下组织相对疏松。 .结论：在人 Tenon’s 囊成纤维细胞(HTF)表型转化以及兔眼滤过术后瘢痕化的模型中，都可以观察到 TGF-βⅠ型受体 ALK5 表达的增加，而通过慢病毒对 HTF细胞及兔眼结膜下组织转染 ALK5 基因，并加入抑制剂 SB-431542 调控 ALK5水平发现，ALK5 高表达一方面能使成纤维细胞增殖加快，促进兔滤过性手术后滤过道瘢痕的形成，另一方面也可能诱导细胞的凋亡从而使纤维化得到控制。加入 ALK5 抑制剂 SB-431542 以后，可以抑制由其产生的细胞增殖以及瘢痕化作用。这说明ALK5 在 TGF-β 引发的瘢痕化中，可能有重要的调控作用。