利用精原干细胞生产转基因巴马小香猪的平台的建立

Spermatogonial stem cell (SSC), which is unipotent stem cell in body to produce sperm, is predicted to be ideal vehicle to produce transgenic animal. To date, using SSC to produce transgenic animal is limited to mouse. In this project, we plan to use SSC of Bama mini-pig as the vehicle to produce transgenic mini-pig..Previous study showed that the testis tissue from newborn mouse could proceed spermatogenesis in medium supplemented with knockout serum replacement (KSR). We design the project basing on this find with new methods: the testis tissues from newborn Bama mini-pig were cultured in medium supplemented with busulfan to eliminate endogenous SSC, then the transfected SSC were transplanted to the tissue and cultured in medium supplemented with KSR and other factors for induction of sperm, or the treated tissues with busulfan were digested into individual cells and co-cultured with transfected SSC in the same medium..We have already isolated Bama mini-pig SSC and cultured in vitro for 30 generation (140 days) to date, it can provide enough SSC for transfection research, which esures the smooth progress of the project. From the research, we try to look for a universal method to produce transgenic animal for mammal using SSC.

精原干细胞因其能分化成精子，而成为很多研究者心目中理想的转基因载体。目前，相关的研究仅限于小鼠，本项目以巴马小香猪精原干细胞为研究对象，尝试生产转基因猪。.已有研究表明，新生小鼠的睾丸组织可以在含有KSR（knockout serum replacement）的培养基中进行减数分裂，并生成精子。根据这个发现，我们让新生巴马小香猪的睾丸组织在含有白消安的培养液中培养，以除去内源性精原干细胞，然后将转染后的精原干细胞移植到白消安处理好的组织中，或者将白消安处理后的组织消化成单个细胞，然后和转染后的精原干细胞共培养，培养液中添加KSR和其它因子，诱导精子。.我们已经将巴马小香猪的精原干细胞成功分离出来，目前为止已经传了30代，这为本项目的开展提供了可靠的研究基础。通过这个项目，我们想为哺乳动物精原干细胞转染、诱导和转基因动物的生产摸索一条通用的途径。

精原干细胞（spermatogonial stem cells, SSCs）位于动物睾丸的精细小管，是动物体内唯一一种定向分化为精子的成体干细胞。分离、纯化和体外培养SSCs，可以为SSCs的体外研究提供必要的实验材料。已有的研究表明小鼠SSCs可以在体外长期培养并能分化成精子细胞，但猪SSCs的体外培养体系还没有建立起来。本研究的主要内容是分离、培养巴马小型猪SSCs，尝试将外源基因导入到细胞中，并定向诱导SSCs分化成精子细胞。.本研究采用组合酶消化法将巴马小型猪睾丸组织消化成分散的细胞，然后通过差异贴壁法分选出SSCs，将分离出的细胞接种到STO饲养层上进行培养，基础培养液为DMEM/F12、0.3% BSA和B27，添加生长因子GDNF、bFGF和Gfrα1, 在5% CO2、37℃条件下培养。实验结果表明SSCs在此培养体系中培养时可以长期传代并形成细胞簇。目前为止，SSCs在体外已经传代达30代。免疫荧光染色结果显示这些细胞表达SSCs生物标志物UCHL1和CDH1，并且可以和植物凝集素DBA结合，细胞簇中部分细胞表达OCT4；RT-PCR检测结果证明这些细胞表达基因nanog、sox2、vasa、uchl1和thy1，鉴定结果证明这些细胞簇是由SSCs组成。.外源基因导入到SSCs中的研究。研究结果表明采用慢病毒感染法可以将外源基因导入到SSCs内，实验发现在MOI(multiplicity of infection)值为50时，可以有效的将GFP基因导入到SSCs内，可以得到阳性细胞簇。.本研究尝试诱导SSCs分化成单倍体细胞。将1月龄睾丸消化成分散的细胞接种到培养皿中，添加培养液α-MEM、10% KSR、3 ng/ml RA、20 ng/ml BMP4、100 ng/ml activin A、200 ng/ml FSH和10 µM T，在 37 oC、5% CO2条件下培养，培养10天后进行鉴定。免疫荧光染色结果发现细胞可表达Stra8和SCP3，qRT-PCR分析结果显示减数分裂相关基因DMC1和PRM1、单倍体细胞基因 TNP1的表达量上调，证明SSCs发生分化并形成了单倍体细胞。.综述所述，我们分离出了巴马小型猪SSCs，建立了SSCs系，将外源基因导入到SSCs中，SSCs经诱导分化成了单倍体细胞，这为精原干细胞的体外研究提供了可靠的材料