氧化应激影响PCV2感染复制的自噬机制及其营养调控研究

Our previous studies have confirmed that oxidative stress plays an import role in enhancing PCV2 replication, and antioxidants can block the promotion of PCV2 replication induced by oxidative stress, but the related mechanisms are still not clear. It has been demonstrateded that oxidative stress can induce cell autophagy and cell autophagy can influence some virus replication, while there is still no report about the role of autophagy in the influence of oxidative stress on virus replication. The present project will investigate the role of autophagy in the influence of oxidative stress on virus replication and its mechanism by using confocal microscopy, Western Blot, transfection of GFP-LC3 Ⅰ plasmid, flow cytometry, real-time PCR, indirect fluorescence assay, knockdown on the autophagy related genes (ATG-5, Beclin-1) and the analysis in the pathway related to the autophagy (mTOR, PI3K). After the supplementation of antioxdants in vivo and in vitro, the nutritional regulation of PCV2 infection will also be studied from the point of view of cell autopahgy. This project will contribute to elucidate pathogenesis of porcine circovirus type 2 and provide a scientific basis for the use of antioxidants such as selenium in the nutritional regulation of PCV2 infection.

我们先前的研究证实，氧化应激可促进猪圆环病毒2 型（PCV2）的感染复制，抗氧化营养素则可阻断氧化应激对PCV2 感染复制的促进作用，但对于其作用机理仍不清楚。相关研究表明，氧化应激可促进细胞自噬，而细胞自噬可影响病毒的感染复制，但对于氧化应激是否通过细胞自噬影响病毒感染复制尚未见报道。本项目拟通过透射电镜观察、蛋白免疫印迹、GFP-LC3 质粒转染、流式细胞术、荧光定量PCR、细胞免疫荧光、自噬关键基因（ATG-5、Beclin-1）的RNA 干扰、自噬信号通路（mTOR、PI3K）的分析等技术手段和方法，研究细胞自噬在氧化应激影响PCV2 感染复制中的作用及其可能机制，并通过添加抗氧化营养素改变细胞或机体的氧化应激状态后，从自噬的角度探讨PCV2 感染复制的营养调控机制。本项目的开展有助于阐明氧化应激影响PCV2感染复制的作用机理，并为抗氧化营养素在调控猪圆环病毒病中的应用提供依据。

猪圆环病毒2型（PCV2）是猪圆环病毒病的致病性病原，但并不是所有感染了PCV2 的猪都会发生猪圆环病毒病，即使是发生猪圆环病毒病，在不同的猪场其发病程度也很不一样，致病病原PCV2的存在以及其它一些额外的感染性或非感染性促发因素是猪圆环病毒病发生的必需条件。我们先前的研究证实，氧化应激可促进猪圆环病毒2型的感染复制，抗氧化营养素则可阻断氧化应激对PCV2感染复制的促进作用，但对于其作用机理仍不清楚。本项目主要从细胞自噬机制研究氧化应激对PCV2 感染复制的影响及其营养调控。自课题立项以来，我们研究了H2O2对PCV2体外复制的影响，应用透射电镜观察、蛋白免疫印迹、GFP-LC3 质粒转染、流式细胞术、定量PCR、细胞免疫荧光、自噬关键基因（ATG-5、Beclin-1）的RNA干扰等技术手段和方法阐明了细胞自噬在氧化应激影响PCV2 感染复制中的作用和机制；通过PK15细胞体外试验与猪体内试验还发现，赭曲霉毒素诱导的氧化应激可通过自噬途径促进PCV2在体内外的复制，进一步说明氧化应激及毒素诱导的氧化应激可能是PCV2发病过程中不可忽视的重要影响环节；进行了硒蛋氨酸阻断赭曲霉毒素A促进PCV2复制的自噬机制研究，研究结果表明，添加硒蛋氨酸是缓解PCV2感染发病的有效策略，自噬则可能是开发新型抗PCV2药物的潜在靶点；进行了硒化黄芪多糖阻断氧化应激促进PCV2复制的自噬机制研究，研究结果表明，硒化黄芪多糖可抑制细胞自噬进而阻断氧化应激对PCV2复制的促进作用，其机制可能与PI3K/AKT信号通路的激活有关；进行了牛磺酸阻断OTA促进PCV2复制的自噬机制研究，研究结果表明，牛磺酸可抑制细胞自噬进而阻断OTA对PCV2复制的促进作用，其机制可能与AMPK/mTOR信号通路有关；研究了谷氨酰胺饥饿对PCV2复制的影响，研究结果表明，谷氨酰胺饥饿可通过减少细胞内GSH浓度提高MAPK p38的磷酸化水平，进而促进PCV2的复制，该研究结果再次验证了氧化应激及营养调控对PCV2复制的影响。本课题阐明了氧化应激促进PCV2感染复制的自噬机制，并为抗氧化营养素在调控猪圆环病毒病中的应用提供了理论依据。