Lin28/Let-7调控的骨髓间充质干细胞移植治疗阿尔茨海默病的实验研究

The clinical utility of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) transplantation in the treatment of Alzheimer's disease (AD) is rapidly expanding. Improving the quality of MSCs grafts and adaptation to the transplant microenvironments of AD pathological state are the prerequisites for success. Based on the former studies of MSCs differentiation into neurons, our research proposes that Lin28/Let-7 may play an important role in the treatment of MSCs transplantation into AD. In accordance with the principles of gain and loss of function, Lin28/Let-7 is targeted and regulated by recombinant adeno-associated virus infection, miRNA mimic or inhibtor transfection. The biological behavior and the variation of neuronal differentiation of MSCs with diverse Lin28/Let-7 are observed by Northern blot,RT-PCR, immunocytochemistry, Western blot, ELISA and other techniques. For further study, MSCs regulated by Lin28/Let-7 are transplanted into AD transgenic mice. We observe the survival and differentiation of MSCs and the histological changes of the local microenvironments. The recovery of learning and memory are assessed by behavioristics. This study may provide new ideas to break the "bottleneck" of MSCs transplantation in the treatment of AD and had important theoretical value and clinical significance.

骨髓间充质干细胞（MSCs）移植治疗阿尔茨海默病（AD）是一种极具潜力的方法。提高MSCs质量，以适应AD病理状态下的移植微环境是其成功前提。通过前期对MSCs神经分化的研究，本课题提出Lin28/Let-7在MSCs移植治疗AD中可能起到多靶点的调控作用。以Lin28/Let-7为靶点，按照Gain和Loss of function原则，拟采用腺相关病毒载体及miRNA mimic/inhibitor转染；Northern Blot、qRT-PCR、免疫细胞化学染色、Western Blot等方法观察不同Lin28/Let-7背景下MSCs生物学行为、神经分化的差异。并将Lin28/Let-7调控的MSCs移植入转基因AD模型小鼠，观察移植物存活、分化及移植局部微环境组织学改变；评估学习、记忆能力恢复情况。为突破MSCs移植治疗AD的技术“瓶颈”提供新的思路，具有重要的理论和临床意义。

阿尔茨海默病（AD）的干细胞移植是一种极具潜力的治疗方法。提高以骨髓间质干细胞（MSCs）为代表的干细胞质量，适应 AD 病理状态下的移植微环境是本课题组多年研究的主要目标。本项目在以往研究基础上，结合了干细胞、生物信息、基因调控等方向的新技术，如microRNA芯片、CRISPR/Cas9基因敲除、活体成像等，成功构建了Let-7家族中11个主要成员（Let-7a、b、c、d、e、f、g、i、miR98、miR202及lin28）的过表达和抑制载体并感染MSCs；通过系统的体内、外实验，全面观察了Let-7修饰前后MSCs的增殖、迁移、存活、神经分化和移植的情况；评估了移植细胞的安全性；探讨了上述生理病理过程中部分重要的信号通路。结果首次发现：1）Let-7家族成员可以促进MSCs向神经细胞分化；Notch-1参与了Let-7调控通路；2）Let-7家族成员可以外泌体形式参与调控移植后MSCs存活、凋亡及分化；3）神经细胞极化蛋白PARD6参与Let-7调控MSCs神经分化；4）Let-7家族成员通过调控NDRG3在AD、脑缺血等病理生理过程中起到重要保护作用；5）Aβ对MSCs具有细胞毒性，可诱导MSCs早期凋亡凋亡，因此AD 病理状态下的微环境是不利于MSCs移植。Let-7可以靶向作用于caspase-3，抑制Aβ诱导的MSCs凋亡，减少胶质细胞的活化，促进移植后MSCs的存活；6） Let-7修饰的MSCs移植到AD模型小鼠脑组织后，学习和记忆能力的神经功能缺损有所改善；7）Let-7家族成员在脑梗死、烟雾病、NMDA脑炎和甲基丙二酸血症等很多神经系统疾病中具有重要作用。本项目的实施，为AD干细胞移植治疗提供了新的解决方案，即以MSCs为工具细胞，Let-7或其他microRNA优化改造，从移植第一步保证细胞质量和安全，才可能建立适合AD患者的移植方式。总之，本项目促进了AD和其他神经系统疾病研究的深入，丰富了干细胞研究的技术手段，拓展了microRNA的临床应用，具有较为重要的理论价值和潜在的临床前景。