离体条件下淀粉-蔗糖代谢途径在不同球型百合小鳞茎发育过程中的功能解析

Lily has unsurpassed beauty and great commercial significance among ornamental bulb flowers. Research on bulb development and formation has critical meaning for lily breeding and domestication of bulb production. The current proposal will use three different bulb types of lily to focus on the differences of starch-sucrose metabolic pathways and source-sink relationship based on an in vitro bulblet development model system. Key time stages during development will be selected to develop transcriptomics analysis to screen out candidate genes in starch-sucrose metabolic pathways. Thereafter, cloning and comparison of those genes (AGPase（AGPL、AGPS）、SUT, etc.) and promoters will be performed. Further gene functional verification for most differentially expressed candidate genes and promoters will be carried out. Multi-approaches including morphological, physiological-biochemical, histocytological, molecular and protein levels will be applied to systematically analyze differences and correlation between lily genotypes and starch-sucrose metabolic pathways in vitro. Accordingly, primary regulation network will be constructed as well. The project fully takes the advantage the special wild germplasm Lilium brownii F. E. Brown ex Miellezvar var. giganteum G.Y. Li & Z. H. Chen distributed in Zhejiang Province. Information obtained from this study will help to clarify the mechanism of bulb development of lily and to provide the theory foundation of starch-sucrose gene modification by exploring the genotype influences on the bulb development.

百合是最具观赏和经济价值的球根花卉，其鳞茎发育和成球研究对百合育种及种球国产化生产具有重要意义。本项目拟以不同球型百合为研究对象，以离体芽研究模型为基础，研究不同基因型百合小鳞茎发育过程中的淀粉-蔗糖代谢及库-源关系差异，选择发育关键节点进行转录组学比较，进一步筛选AGPase（AGPL、AGPS）、SUT等淀粉-蔗糖代谢途径的关键候选基因，并对候选基因及启动子进行克隆及比较，进而对差异最显著的候选基因及启动子开展初步功能验证。本研究试图从形态、生理生化、组织及细胞、分子、蛋白等多水平层层深入，系统剖析不同基因型离体小鳞茎发育过程与淀粉-蔗糖代谢路径的关联性，并初步构建其差异调控网络。本项目充分利用巨球百合这一产自浙江省的特异野生百合种质，从淀粉-蔗糖角度解析基因型对鳞茎发育的影响，将为阐明百合鳞茎发育机理和淀粉-蔗糖基因修饰奠定理论基础。

百合(Lilium spp.) 是兼具观赏价值及食药用价值的著名球根花卉，但由于其种球自然繁殖率低、童龄期长，导致长期存在育种和繁育周期长的问题，而利用离体小鳞茎研究其发生及发育进程的分子机制，有助于解析百合鳞茎发育的调控机理。本项目选取浙江省特异种质巨球百合（Lilium brownii var. giganteum）及其原种野百合（L. brownii）、参照系东方百合品种‘索邦’（L. Oriental Hybrid ‘Sorbonne’）为材料展开系列研究，结果表明：（1）在培养基养分充足的条件下，巨球百合的鳞茎发生能力在三个种质中最优，主要体现在新生小鳞茎发生数量多。与野百合相比，更加依赖于外源蔗糖的能量供给和诱导；（2）通过PacBio测序技术建立了三个种质百合小鳞茎发生过程的参考全长转录组，基于Illumina测序比对参考全长转录本并进行联合分析，提出了碳水化合物代谢通路是小鳞茎发生创伤响应阶段的重要通路；（3）采用RACE技术克隆了巨球百合及‘索邦’的淀粉合成关键酶AGPS、GBSS、SSS基因，qPCR结果显示这三个基因在巨球百合离体鳞茎中的相对表达量均显著高于其他组织，推测其可能在百合鳞茎膨大过程中发挥作用；（4）克隆了巨球百合蔗糖代谢途径的关键酶——细胞壁转化酶的编码基因LbgCWIN1，全长为2928 bp，编码574 aa的氨基酸。qPCR结果显示该基因在不同外源蔗糖浓度下的表达模式有明显差异。在拟南芥中过表达该基因，发现外源蔗糖处理对拟南芥种子萌发有影响，但过表植株与WT相比尚无显著表型差异；（5）通过染色体步移法克隆得到2718 bp的LbgCWIN1基因的启动子序列，元件分析表明该启动子可能对逆境胁迫及蔗糖等因素有响应。且启动子5’缺失试验结果显示，保留启动子459 bp DNA序列能够保持完整的启动活性，大量启动下游报告基因的表达。以上结果为离体条件下不同百合淀粉-蔗糖代谢通路调控鳞茎发生及发育机制提供了新证据，为今后全面阐明百合鳞茎发生发育的分子调控机理奠定了理论基础。