百合鳞茎“蔗糖-淀粉”代谢途径中SuSy和AI基因的生理功能研究

蔗糖是百合韧皮部同化物运输和鳞茎可溶性碳水化合物的主要形态，须由SuSy或AI降解进入淀粉代谢途径，而淀粉含量决定了百合种球质量以及鲜切花品质。目前，百合SuSy与AI基因的功能及其如何参与淀粉代谢尚不清楚。本研究在明确小鳞茎形成发育与淀粉积累及蔗糖代谢密切相关的基础上，通过从鳞茎cDNA文库克隆出的SuSy、AI家族基因全长cDNA，构建原核表达、超表达和RNAi载体，采用原核表达技术分离纯化目标酶并进行酶学性质研究；以SuSy、AI基因上调表达和下调表达获得转基因百合植株，进而取鳞片繁殖小鳞茎，分析小鳞茎发育和淀粉积累过程中SuSy、AI的酶活性及其在转录水平和蛋白水平的动态变化，阐明百合SuSy、AI基因功能及其在"蔗糖-淀粉"代谢途径中的调节机理，为明确百合鳞茎淀粉代谢机制奠定生理学基础、并为生产优质种球提供实践依据。

淀粉是百合鳞茎的主要贮藏物质，淀粉含量决定了种球质量。蔗糖是百合碳水化合物运输的主要形式，而SuSy和AI是蔗糖代谢途径的关键酶。为阐明百合SuSy和AI基因在“淀粉-蔗糖”途径中的功能，本课题进行了如下研究：1.在鳞茎发育的关键时期取样进行转录组测序，最终得到52 901个unigene，通过注释分析发现多个unigene参与碳水化合物代谢。2.使用四种软件评价了α-TUB、β-TUB、ACT、AP4、eIF、GAPDH、FP、RH2、UBQ、UBC、18S和60S等12个内参基因在不同试验条件下的表达稳定性，分别筛选得到在不同组织器官、不同发育过程以及不同逆境胁迫后表达最稳定的内参基因，为准确实施百合实时荧光定量PCR提供了保证。3.利用数字化表达谱测序，筛选不同样品中的差异表达基因，发现小鳞茎形成始期物质代谢较为活跃，差异表达基因数目最多；代谢通路分析发现，淀粉-蔗糖代谢占主要位置。4.碳水化合物含量测定结果表明，小鳞茎形成与发育过程中母鳞片中淀粉含量下降，而小鳞茎中淀粉含量上升；母鳞片中蔗糖含量在小鳞茎形成与发育阶段急剧下降，而小鳞茎中蔗糖含量在此期间显著增加。5.基因时空表达结果表明：小鳞茎出现与形态建成阶段，蔗糖降解方向相关酶在母鳞片中的基因表达量要高于小鳞茎，而小鳞茎膨大阶段则主要在小鳞茎中表达。蔗糖合成方向相关酶在母鳞片中的基因表达量呈下降趋势，而在小鳞茎中的表达量在形态建成阶段较高。淀粉合成相关酶在小鳞茎中的表达丰度要高于母鳞片中的表达丰度，且以支链淀粉合成相关酶为主；而淀粉分解相关酶的基因表达量在母鳞片中较高。6.克隆在百合小鳞茎形成与发育过程中差异表达的SuSy家族基因SuSy1、SuSy2、SuSy3和AI家族基因SAI的基因全长cDNA，并构建其原核表达载体、过表达载体与RNAi载体，并完成SuSy与AI的过表达和RNAi载体对兰州百合的遗传转化。本研究初步明确了百合小鳞茎形成过程中SuSy以及AI在淀粉代谢途径中的生理功能，为最终阐明淀粉代谢机制、生产优质种球奠定了基础。已发表SCI学术论文3篇，申报国家发明专利3项，获辽宁省自然科学学术成果奖1项。