基于谷氨酸棒杆菌α-酮酸代谢的异戊醇生物合成基础研究

异戊醇作为一种重要的有机化工原料，用做液体燃料具有比乙醇、正丁醇和正戊醇更适合作为燃料的特性。经由α-酮酸的脱羧和还原途径合成异戊醇等醇类为人们提供了一种长链燃料醇生物合成的新颖思路。国外在利用大肠杆菌生产异丁醇等长链醇方面进行了较多的探索，但在利用谷氨酸棒杆菌为宿主菌构建可同时利用木糖高产异戊醇基因工程菌方面还鲜有报道，国内更是缺乏相关支链醇的生物合成报道。本项目拟以谷氨酸棒杆菌为宿主菌，通过基因敲除和过量表达等分子操作手段，使宿主菌能够代谢利用木糖，提高异戊醇合成关键前体物α-酮异戊酸和α-酮异已酸的产量，减少旁路亮氨酸等合成代谢的碳源损失，构建出能同时利用木糖高产异戊醇的基因工程菌，阐明异戊醇高效生物合成的机制。本项目研究预期能够实现异戊醇合成基因在谷氨酸棒杆菌中的高效表达，有效拓展异戊醇生物合成表达宿主菌的范围，为其它支链长链醇的生物合成研究提供重要的理论和科学依据.

作为一种重要的有机化工原料，异戊醇用做液体燃料具有比乙醇、正丁醇和正戊醇更适合作为燃料的特性。目前，利用生物法合成异戊醇等长链醇类具有安全、稳定等优点，国外在此方面进行了较多的探索。我们对谷氨酸棒杆菌为宿主菌，构建共利用木糖-葡萄糖生物合成异戊醇工程菌。首先，将大肠杆菌来源的木糖异构酶与木酮糖激酶导入谷氨酸棒杆菌，获得能利用木糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株；随后，将相应酸醛醇转化途径基因导入宿主菌，该途径中的酮酸脱羧酶与醇脱氢酶可将氨基酸合成途径中的中间产物-α-酮酸通过氧化-还原反应转化成相应的长链醇；接着，对宿主菌的亮氨酸合成途径进行了改造，途径中的关键酶基因被加强表达，以获得更多的中间产物酮异己酸，提高终产物异戊醇的合成量。同时，敲除丙酮酸底物竞争的其它途径，促进丙酮酸流向亮氨酸合成途径，进一步提高酮异己酸的累积。我们还通过化学诱导的方法，获得能耐受高浓度亮氨酸的突变株。通过这些手段，获得能产异戊醇的谷氨酸棒杆菌重组菌株。