饮食胆固醇吸收的分子机制与功能调控

Dietary cholesterol absorption by small intestine is a major way for humans to obtain cholesterol. Excessive absorption is a major reason of hyperlipidemia that often causes metabolic diseases including atherosclerosis and type II diabetes. The NPC1L1 protein is the gatekeeper of diatery cholesterol absorption. Our previous studies have found that it interacts with lipid raft proteins called Flotillins to form cholesterol-rich membrane microdomains, which are internalized through Clathrin/AP2 pathway, and therefore cholesterol is taken up. Ezetimibe, a cholesterol-lowering drug, inhibits cholesterol absorption by blocking the endocytosis of NPC1L1. We have also identified several other proteins including Rab11a, Rab11FIP2, MyoVb and Cdc42 involved in cholesterol absorption. We demonstrate that the polymorphism in NPC1L1 gene causes low cholesterol absorption in human individuals. Based the above progresses, this proposal will use biochemical and genetic approches to identify novel proteins involved in NPC1L1-mediated cholesterol absorption, illustrate the working mechanisms, and discover the signaling. We will also make genetic mice models to study their functions in vivo. This study will deepen our understanding about cholesterol absorption and regulation, and pave new avenues to develop novel lipid-lowering drugs.

小肠对饮食胆固醇的吸收，是人体获得胆固醇的主要途径。吸收过多是导致高脂血症并引发一系列代谢性疾病的重要原因。NPC1L1蛋白是介导饮食胆固醇吸收的关键蛋白质，我们前期研究发现它和脂质筏蛋白Flotillin形成富含胆固醇的膜结构域，通过囊泡内吞机制将饮食胆固醇运进细胞内；证明降脂药物依折麦布阻断NPC1L1内吞而抑制胆固醇吸收；鉴定出介导NPC1L1由细胞内向质膜转运的蛋白复合物；并证明人群中NPC1L1基因多态性与胆固醇吸收紧密关联。在此基础上，本项目将结合生物化学和遗传学方法，筛选鉴定NPC1L1介导胆固醇吸收过程中各个阶段的新蛋白，阐明其作用机制；揭示胆固醇吸收的调控机理和相关信号转导途径；构建小鼠模型，在动物水平研究胆固醇吸收关键蛋白的生理功能和疾病发生相关机理。此工作将深入揭示饮食胆固醇吸收的机制和调控，为相关疾病的防治和药物研发提供基础。

从肠道中吸收胆固醇是人体获得胆固醇的一个重要方式，深入研究其调控机制将为防治胆固醇代谢性疾病提供重要理论基础。Niemann Pick C1 like 1（NPC1L1）蛋白是在肝肠胆固醇吸收过程中起重要作用的多次跨膜蛋白，它通过膜泡运输的形式运送胆固醇进入细胞内。本研究利用化学诱变结合流式细胞分选的筛选方法，发现NPC1L1的C端（NPC1L1-C）YVNxxF序列（x为任意氨基酸）对NPC1L1的内吞和胆固醇吸收有重要作用。然后通过酵母双杂交实验，我们鉴定出与该序列直接相互作用的蛋白为Numb。Numb通过连接NPC1L1-C和Clathrin，从而介导NPC1L1和胆固醇的内吞。在细胞中基因沉默Numb蛋白后显著减慢NPC1L1的内吞和胆固醇的吸收。进一步，我们发现低胆固醇水平时，YVNxxF序列结合质膜。NPC1L1蛋白N端结构域结合胆固醇后，NPC1L1发生构象变化，其C端的YVNxxF序列从质膜中暴露出来，结合Numb，而招募AP2和Clathrin等，起始NPC1L1的内吞。这些发现，揭示了胆固醇诱导NPC1L1蛋白内吞的分子机制。同时我们用全外显子组测序的方法在一个新疆哈萨克族家系中鉴定出CAR-K306fs突变和血浆低LDL-C水平有关，CAR蛋白在小鼠小肠组织高表达，并且定位在小肠绒毛上皮细胞刷状缘膜上。CAR基因小肠特异性敲除小鼠（I-CAR-/-）的胆固醇吸收下降，并且I-CAR-/-小鼠能抵抗饮食诱导的高胆固醇血症。在细胞和分子水平研究发现CAR蛋白介导NPC1L1蛋白和myosin Vb蛋白的结合，参与NPC1L1蛋白的细胞内转运，多肽竞争实验发现阻断CAR和NPC1L1的结合可以抑制NPC1L1介导的胆固醇吸收。阻断CAR和NPC1L1的结合可以抑制NPC1L1介导的胆固醇吸收。.综上，本研究发现了NPC1L1蛋白上一特异性内吞Motif，其通过结合Numb蛋白发生囊泡内吞，介导小肠胆固醇吸收，阻断NPC1L1-Numb结合可有效抑制胆固醇吸收。同时从新疆哈萨克族人中鉴定出CAR基因的2个突变（K306fs和L25I）和血浆低LDL-C水平有关，阻断CAR和NPC1L1的结合可以抑制NPC1L1介导的胆固醇吸收。该研究深入揭示了小肠胆固醇吸收的分子机制，并为发展新型降胆固醇药物提供了策略。