RIP1/RIP3调控在广州管圆线虫感染所致神经元损伤中的作用及机制研究

Angiostrongyliasis, is caused by the infection of Angiostrongylus cantonensis (A. cantonensis), a kind of worm which invades host central nervous system (CNS) and causes eosinophilic meningitis and meningoencephalitis. Receptor interacting protein 1 (RIP1) is a kind of important regulatory molecules, which plays a key role in cell apoptosis, cell survival and cell necrosis, and is a hot spot of studying signal transduction of cell survival and die.Our previous research showed that neuron expressed RIP1 in cortex and hippocampus and the level of RIP1 expression positively correlated with Caspase-3 expression level and neuron apoptosis and necrosis in the brain after A. Cantonensis infection. That indicated RIP1 play an important role in neural apoptosis and necrosis induced by A. Cantonensis infection.On this basis, methods including cell and animal models,animal behavior test, morphology and molecular biological technology and specific inhibitors would be used to demonstrate①To confirm that the neuronal injury induced by A. Cantonensis infection can be triggered by RIP1 and be inhibited by the specific inhibitor.②To further explore the molecular mechanism of RIP1 regulating neuronal apoptosis and necrosis after A. Cantonensis infection.③To explore the activation of RIP1 affected by the antigen from A. Cantonensis and figure out which factors could trigger the process of RIP1- mediated apoptosis and necrosis. These results of the project will contribute to reveal the mechanism of neuronal injury in angiostrongyliasis and provide a theoretical basis for understanding the pathogenesis and finding a new therapeutic target of this disease.

广州管圆线虫（Ac）感染主要引起嗜酸性粒细胞增多性脑炎和脑膜脑炎，导致神经元严重损伤。受体相互作用蛋白1（RIP1）是一种重要的调控分子，在细胞凋亡、存活及程序性坏死中起关键作用，是研究细胞生存或死亡信号转导的热点和核心问题之一。我们前期研究表明，小鼠感染Ac后，神经元明显损伤并死亡，皮质和海马区域神经元大量表达RIP1且其水平与Caspase-3表达水平以及神经元损伤和死亡呈正相关，且RIP3在感染宿主脑内表达上调。提示RIP1/RIP3在Ac感染所致神经元损伤死亡过程中发挥重要作用。为此，本项目结合体内外实验，采用行为学、形态学和分子生物学等技术方法，并利用特异性抑制剂等手段，①证实Ac感染所致神经元损伤为RIP1激活所致并能被相关抑制剂所抑制；②探明RIP1对神经元损伤调控的分子机制；③探究感染宿主激活RIP1通路的因素，为明确广州管圆线虫病的发病机制及优化治疗方案提供新的理论依据

广州管圆线虫病是由广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis 简称Ac）侵入人体引起的以中枢神经系统症状为主的感染性寄生虫疾病。其该病没有特异性治疗方法，虽然常规治疗可使患者症状得以缓解，但神经损伤的发病机制这一核心问题仍未解决，因此不少患者治愈后仍有神经损伤的后遗症。为此，深入研究Ac感染致中枢神经系统损伤机制，对寻找具有针对性、有效性的神经元保护方法和药物均具有重大意义。借助Micro-PET/CT和核磁共振成像（MRI）技术动态观察感染动物脑部病变的进展，结果表明，MRI的表现主要为脑水肿、脑积水，包括侧脑室和蛛网膜下腔的扩大，在感染4W的小鼠甚至出现皮质与皮质下结构的分离，而Micro-PET/CT则呈现脑细胞糖摄取能力持续进行性下降。感染Ac最具特异性的病理特征是脑实质斑块状病灶区的形成。借助星形胶质细胞抗体（GFAP）免疫组化方法，探察Ac感染对脑实质内星形胶质细胞的影响，结果显示感染Ac的大鼠和小鼠脑实质病灶区周围星形胶质细胞出现增殖、胞体肥大和突起增粗，且感染3W小鼠星形胶质细胞反应最为强烈。小胶质细胞被认为是中枢神经系内源性免疫细胞，借助小胶质细胞特异性抗体（Iba1）进行免疫组化探察，结果显示，感染Ac的大鼠和小鼠脑局部病灶区及其周边区的小胶质细胞呈现强烈的肥大和增生性变化，甚至可见胞体圆形、突起短细的阿米巴样阳性细胞。借助免疫荧光双标记证实感染Ac的大鼠和小鼠脑局部病灶区激活的小胶质细胞呈现明显的IL-6和IL-1β的阳性反应，进一步PCR探察显示在感染3w小鼠脑IL-6表达明显上升。小鼠转录组数据分析，显示凋亡相关蛋白及受体RIP1（RIPK1）、TNFR1、Fas和Caspase-8都出现时相性表达上调。RIP1作为细胞程序性死亡的主要调控因子，在细胞生死存亡中起关键作用。RIP1免疫组化和RIP1与NeuN免疫荧光双标记的探查显示，RIP1主要表达于皮质运动区的Ⅳ层和Ⅴ层以及海马齿状回。以上证据显示，感染Ac导致脑内小胶质细胞活化并表达大量相关炎症因子，诱导相应区域神经元RIP1表达的上调，从而激活一系列的细胞死亡程序，最后导致神经元的凋亡和丢失。