超声靶向破坏VEGFR-Ab标记的磁性微泡介导PDGF-BB基因转染诱导干细胞分化干预腹主动脉瘤病程的研究

One of the major pathological changes of abdominal aortic aneurysm(AAA) is apoptosis of vascular smooth muscle cells(VSMCs). Stem cells recently identified in AAAs, localize and proliferate within injured arteries. It is hopeful for intervening the progress of AAA if stem cells can differentiate to VSMCs. In vitro PDGF-BB has the ability to induce the differentiation of stem cells to VSMCs. Endothelial cells located at injured aorta within AAA highly express VEGFR, which is suitable as a targeted chemotactic factor. This research focuses on developing a new type of magnetic microbubble with VEGFR-Ab marker, which could be given intravenously, guided under external magnetic field and destroyed by ultrasound ,in order to transfer the PDGF-BB plasmid to endothelial cells in AAA model of rat. Based on several methods, such as fluorescent light to detect the transfection efficiency, RT-PCR and Western-Blot to detect the expression of PDGF-BB,HE staining to detect the amount of VSMCs in media and immunohistochemistry to detect the differentiation of stem cells, combined with the dynamic observation of aortic diameter by ultrasound, it is feasible to evaluate the therapy. If there exist local upregulation of PDGF-BB, increase of VSMCs in media and decrease of AAA diameter, it would be a new noninvasive clinical treatment strategy for AAA in the future.

腹主动脉瘤（AAA）主要病理改变之一为平滑肌细胞减少，研究证实瘤体周围有大量干细胞聚集，若能诱导其分化为平滑肌细胞，则可望控制AAA病程进展。体外实验证实PDGF-BB可诱导干细胞向平滑肌细胞分化。AAA瘤血管内皮高表达VEGFR，可作为靶向趋化因子。本研究旨在构建携带PDGF-BB质粒的VEGFR-Ab标记的磁性微泡，通过静脉注射微泡并在AAA体表外加磁场，促使微泡靶向聚集，经超声辐照介导微泡破裂释放PDGF-BB转染大鼠模型AAA血管内皮细胞，应用荧光观察转染率、RT-PCR、Western-Blot检测局部PDGF-BB表达，HE染色检测平滑肌细胞数目，免疫组化检测等方法观察局部转染及干细胞分化情况，并通过超声动态观察瘤径变化评价疗效。如能促使局部PDGF-BB上调，瘤体血管壁平滑肌细胞增加，瘤径缩小，则为AAA临床治疗提供了新的思路。

目的：超声靶向微泡破坏(UTMD)联合靶向磁性微泡技术促进pPDGF-BB转染血管内皮细胞，诱导干细胞向血管平滑肌细胞（SMC）分化，对小鼠腹主动脉瘤（AAA）病程进展的干预研究。方法：体外研究：血管内皮细胞分为6组：（1）NC组（正常对照），（2）MMB组（磁性微泡，携带PDGF-BB质粒DNA），（3）MMB+MF组（磁性微泡+外加磁场），（4）MB+US组（非磁性微泡+超声辐照），（5）MB+MF+US组（非磁性微泡+外加磁场+超声辐照），（6）MMB+MF+US组（磁性微泡+外加磁场+超声辐照）。UTMD联合磁性微泡或者普通为微泡介 导pPDGF-BB和对照质粒分别对上述各组进行转染，检测转染效率，WB检测PDGF-BB蛋白表达。体内研究：建立腹主动脉瘤模型（8周大小Apoe-/-雄性小鼠给予高脂饮食喂养4周后，再给予血管紧张素II刺激4周），随机分为：对照组（给予超声辐照及外加磁场），UTMD+MB（超声靶向微泡破坏联合普通微泡治疗组），UTMD+MMB（超声靶向微泡破坏联合磁性微泡治疗组）。超声评估小鼠腹主动脉内径，比较各组腹主动脉瘤发病率，死亡率，检测超声辐照部位干细胞迁移情况，免疫荧光双标检测干细胞转化为SMC情况。结果: 体外研究：荧光显微镜观察转染效率，MMB+MF+US组与MB+MF+US组，MMB+MF组，MB+US组，MMB组，NC组相比较，转染效率最高（P<0.05）。Western-blot检测PDGF-BB蛋白表达情况，结果显示MMB+MF+US组PDGF-BB蛋白表达与其他各组相比较表达水平最高（P<0.05），各组之间不同指标两两比较差异具有统计学意义。体内研究：超声测量各组小鼠腹主动脉直径，UTMD+MMB磁性微泡治疗组小鼠腹主动脉直径明显小于UTMD+MB组及对照组（P<0.05）。UTMD+MMB组显著降低腹主动脉瘤发生率，腹主动脉瘤破裂引起的死亡率，提高小鼠28天存活率（P<0.05）。荧光显微镜下观察，发现UTMD+MMB组主动脉组织中GFP阳性骨髓干细胞数量最多 (P<0.05)。进一步免疫荧光双标染色结果显示UTMD+MMB组血管组织中可见大量GFP及SM-22α双阳性细胞。结论：UTMD介导磁性微泡可提高质粒转染效率。UTMD联合磁性微泡局部过表达PDGF-BB，可吸引干细胞迁移至病变血管并可转化为血管平滑肌细胞