LuxR家族蛋白调控茂原链霉菌TGase合成的机制研究

Transglutaminase (shorten as TGase) is a family of enzymes that can catalyze the cross-linking of proteins to modify the functional properties of protein. It attacts a great interest. The previous results showed that MgCl2 stress improved the TGase production from Streptomyces mobaraensis and inhibited the expression of LuxR family protein. In this study, we will analyse the effects of MgCl2 stress on the gene transcription in S. mobaraensis and confirm the key gene of control LuxR family protein for regulating TGase synthesis by gene chip technology and bioinformatics analysis. Using gene silencing technology, LuxR family protein gene disruption strain and restored mutant will be constructed. Proteomics will be exploited to analyse differentially expressed proteins in disruption strains, restored mutation and wild stain. Metabolics will be used to study their changes of metabolic pathways and metabolites. In addition, changes in cell morphology of three strains will be observed. Based on above study, the mechanism of regulation TGase synthesis by LuxR family proteins will be elucidated. At the same time, the mechanism will be used to improve the TGase synthesis , which will lay the foundation for large-scale production.

谷氨酰胺转氨酶（Transglutaminase，简称TGase）又名转谷氨酰胺酶，通过催化蛋白质发生交联，改善蛋白质的功能特性，受到了广泛关注。 在前期研究结果表明MgCl2胁迫促进了茂原链霉菌TGase合成，蛋白质组学研究结果表明它抑制了LuxR家族蛋白的表达。本项目将利用基因芯片技术和生物信息学分析，研究MgCl2胁迫对Streptomyces mobaraensis基因转录的影响，确定与TGase合成有关的调控LuxR家族蛋白表达的基因。利用基因突变技术，构建LuxR家族蛋白基因的阻断株和恢复突变株。利用蛋白质组学方法研究基因阻断株、恢复突变株以及野生菌株的胞内蛋白质表达的差异；利用代谢组学方法研究这三株菌的代谢路径和代谢产物的变化。另外，通过测定三株菌的生产性能,菌体形态变化，阐明LuxR家族蛋白调控TGase合成的机制。同时利用这种机制调控TGase合成，为大规模生产奠定基础。

本研究通过基因重组技术阻断茂原链霉菌luxR基因，构建突变菌。通过对比分析突变菌与野生菌在普通发酵培养基和MgCl2发酵培养基中的TGase、及其关键蛋白酶的合成情况、胞内蛋白变化情况和菌体形态分化，来阐明LuxR家族蛋白对TGase合成的调控作用，确定TGase合成的机制。为获得luxR基因阻断突变菌，本文以pKC1139为载体构建luxR基因阻断质粒，通过PEG介导的质粒转化将其转入茂原链霉菌原生质体中，单交换同源重组法将整个重组质粒插入到链霉菌基因组中以阻断luxR基因的表达，成功地构建出茂原链霉菌luxR基因阻断突变菌。通过对比luxR基因工程菌株和野生菌的TGase在发酵过程的活力分析和菌体干重量变化，发现阻断luxR家族蛋白的合成不利于TGase的合成的菌体的生长。另外通过发酵上清液的SDS-PAGE分析和蛋白酶活力变化比较，发现luxR基因阻断不利于蛋白酶的合成，从而降低了酶原向活性TGase的转化。采用扫描电子显微技术研究了luxR基因阻断菌株和野生菌在发酵过程中的菌体形态变化。结果发现与野生菌相比突变菌菌丝更短，呈不规则弯曲状态较为杂乱，菌丝分化时间延迟，没有淀粉样现象。双向电泳及质谱分析结果显示，luxR基因阻断突变菌中的参与菌体生长的初级代谢酶表达量下降，因此抑制了菌体的合成。并且参与TGase合成的关键酶，如参与合成TGase的限制性氨基酸Glycine的GlnA表达量下降，这使得luxR基因阻断突变菌的TGase合成量下降。根据以上的研究结果，在摇瓶发酵过程中，联合环境因子和外源诱导物对LuxR家族蛋白合成进行调控，建立了TGase合成的调控模型。本研究为TGase大规模生产和应用奠定基础。