Nanog基因对中华鳖雌性生殖干细胞发育分化的调控机制研究

Germline stem cells (GSCs) are pluripotent and can differentiate into gametes. GSCs of aquatic species are invaluable basis for the studies on reproduction development and the elite breeding. The stem cell transcription factor nanog gene is also a biomarker for GSCs, yet its functions involved in GSCs development are still unclear. Our group has recently obtained a female germline stem cells (fGSCs) line from the Chinese softshell turtle and found that nanog was abundantly expressed in these cells. Therefore, in this study, we aim to study how reptilian nanog regulates the development and differentiation of fGSCs using the Chinese softshell turtle as a model. Firstly, We will identify the core promoter and regulatory elements of nanog through gene transfer and reporter assays in the fGSCs. Next, we will use nanog as a biomarker to trace the development and distribution of fGSCs in the ovaries of Chinese softshell turtles. We will also study the modulations of nanog on the fGSCs development through gene overexpression/editing. Finally, we plan to elucidate the regulators’ network modulated by Nanog during maintaining the fGSCs pluripotency through comparative transcriptomics and proteomic analyses, Chip-seq as well as GST pulldown coupled with MS analyses. This study can provide basis for further investigations in turtles, including reproduction and development biology, technological development in elite breeding. It can also shed new light on the understanding and application of the fGSCs in vertebrates.

生殖干细胞（GSCs）是一类能分化成配子的多能干细胞，是动物生殖发育研究及良种创制技术研发的细胞基础。Nanog基因是动物GSCs的标志基因，但其调控GSCs发育的分子机制还不明确。本研究组最近培养了中华鳖卵巢生殖干细胞（fGSCs）系，并发现nanog基因在该细胞中高表达。因此，本项目拟将以中华鳖为模型，研究nanog基因对fGSCs发育的调控机制：通过基因转移及报告基因表达分析，确定nanog的核心启动子及转录调控元件；以nanog作标记分子，追踪研究中华鳖卵巢中fGSCs的发育及组织分布情况；通过基因过表达和编辑技术，分析nanog基因对fGSCs发育分化的作用；利用比较组学分析、Chip-seq与GST pulldown质谱联用技术鉴定nanog基因调控fGSCs发育的基因调控网络。本研究的实施能为将来进行其他脊椎动物fGSCs的基础和应用研究提供新的线索。

生殖干细胞（GSCs），是一类多能性干细胞，既具有自我更新的能力又具有发育生成配子的潜能。GSCs在水生动物生殖发育、性控育种、良种创制及濒危珍稀物种保护等研究中均有无可替代的研究及应用价值。本项目通过分析nanog对中华鳖雌性生殖干细胞（fGSCs）发育分化的调控机制及生殖细胞发育相关的研究，较为系统地进行了龟鳖类生殖细胞的鉴定、体外培养及发育分化等研究。主要研究内容及结果包括：1）分析鉴定出nanog的核心启动子及转录调控元件，主要位于中华鳖nanog基因5’端上游1.5kb区域；并通过nanog基因cDNA全长序列的克隆及表达分析，并初步确定了nanog基因主要调控雌、雄性腺的早期生殖细胞的发育；同时鉴定了中华鳖卵巢中fGSCs的发育及组织分布情况；2）进行了中华鳖生殖细胞相关基因的克隆分析，包括dazl, dnd1、dmc1、rad51等基因的克隆分析；3）通过基因过表达和敲降技术，分析Nanog基因对fGSCs和雄性生殖细胞发育分化的调控作用；发现nanog基因的表达水平显著影响中华鳖生殖细胞的生长、发育与分化，而且调控性腺发育相关基因的表达，如sox9,gata 6,xrcc6等基因；4） 进一步利用比较转录组学和蛋白组学分析了nanog基因调控fGSCs和性腺组织发育的基因调控网络；发现中华鳖Nanog蛋白可能与生殖细胞发育相关基因通过互作，进而调控龟鳖动物生殖细胞的发育分化；5）进行了黄喉拟水龟卵巢细胞的分离培养建系及诱导分化潜能等方面的研究，且获得了黄喉拟水龟卵巢细胞系（YTO2），该细胞系高表达生殖干细胞基因，包括Rad5l, Tdrd7等生殖细胞蛋白，及PCNA蛋白；RA能诱导YTO2，使得dazl，dmc1等减数分裂起始相关基因的表达水平显著增加，而且含Tdrd7-GFP融合蛋白过表达的腺病毒能高效感染YTO2细胞；这些结果证明YTO2具进行减数的潜能，并可以作为生殖发育相关基因功能分析的体外研究体系。总之，本课题研究结果为将来进行龟鳖动物生殖发育研究及种质改良技术的研发等奠定了基础。