消除CRISPR系统RNA内切酶毒性方法的系统性研究

The design and optimization of synthetic biological parts require the engineering of natural genetic elements in certain hosts, which inevitably involve rebuilding and harnessing functions from other organisms. However, heterologously expressed genetic elements usually bring cytotoxic effects, such as growth inhibition, to host cells. For instance, the applicant has, for the first time, designed a translational activator to regulate gene expression, based on CRISPR endoribonucleases’ capability to specifically recognize and cleave certain RNA sequences and structures. But, within this part, the CRISPR endoribonuclease component, such as Csy4, brings toxicity to the host cells, which limits greatly limits its further application. In this project, we will systematically investigate the principles and methods to avoid or eliminate the cytotoxicity of CRISPR endoribonucleases, in order to optimize the synthetic parts containing such enzymes and to provide new research paradigms for addressing other cytotoxic proteins. On one hand, novel high-efficiency, low-toxicity CRISPR endoribonucleases could be acquired from the vast natural reserve of CRISPR systems through certain selection method. One the other hand, employing the protein evolution strategy to Csy4 and other known toxic CRISPR endoribonucleases could generate mutants which have low cytotoxicity.

在合成生物元件的理性设计和优化过程中，对天然基因元件的工程化不可避免地需要在特定物种中重现其他物种的功能并加以利用。然而，异源表达的基因元件常常对宿主产生毒性，表现为对其生长造成显著抑制。例如，申请人首次人工设计的一种能够在翻译层面调控基因表达的翻译激活元件，是基于CRISPR系统RNA内切酶对特定RNA序列和结构的特异性识别和切割功能。但在此元件中，以Csy4为代表的RNA内切酶普遍存在异源表达毒性，限制了该元件的进一步应用。本项目将系统性地研究如何避免和消除此类毒性的设计原理与方法，以提高翻译激活元件的实用性，并为消除其它基因元件的异源表达毒性提供研究范式。一方面，通过特定方式对不同物种中CRISPR系统RNA内切酶的筛选，获得新型的低毒，高活性酶；另一方面，利用蛋白质定向进化的方法，设计合适的遗传回路对Csy4及其他具有类似毒性的RNA内切酶进行定向进化，筛选高效率，低毒性的突变体。

蛋白质带来的毒性是合成生物元件设计的一个重要障碍。本项目的目的是对蛋白质元件毒性产生的原理进行探究，以及寻找降低其毒性的通用设计方法，为设计更加复杂，高效的合成生物元件提供基础。本项目初始设计以CRISPR系统中的核酸内切酶Csy4作为研究对象，通过蛋白定向进化、转录组测序手段，对其毒性产生原因进行了探索，未获得明确的结论。所以，本项目转换思路，根据“建物致知”的理念，转向构建低毒性的蛋白元件。具体而言，根据对TetR家族的蛋白PhlF进行的前期研究，我们成功设计出基于PhlF-CI434的蛋白元件，即降低了PhlF的毒性，又获得了更良好的调控效果。利用该蛋白元件，本项目设计出了基于DAPG信号分子的细胞通讯系统，成为一个具有10种模块化、正交化，可跨物种使用的细胞通讯系统的工具包的组成部分。该工具包突破了目前存在的细胞间通讯元件数量少，质量差的瓶颈，将大大促进更复杂的多细胞人工遗传回路的设计，促进更加智能化的微生物发酵、人造组织器官、不依赖抗生素的病原体控制等领域的发展。