一氧化氮相关蛋白SAP对巨噬细胞天然免疫信号通路调控的分子机制

STING is a key adaptor protein of the innate immune system against DNA virus. STING deficiency abrogates the innate immunity signaling while excessive activation of STING leads to serious autoimmune diseases. The regulation mechanism of STING activity is not fully clear now. In our screen of STING interacting proteins, we found nitric oxide-associated protein SAP (STING associated protein) and STING reciprocally regulate each other to enable efficient antiviral signaling activation. SAP could negatively regulate the activity of STING pathway and influence the localization of MAVS, while TBK1, which is a key kinase in the STING signaling pathway, could phosphorylate SAP. As nitric oxide is an important active immune molecule in the process of macrophage activation, therefore, we will explore the molecular regulation mechanism of STING and SAP activation and explain whether the phosphorylation of SAP by TBK1 is important for STING pathway or nitric oxide pathway. Our study will provide the basis for the coordination mechanism of the interferon and nitric oxide signaling pathway in macrophage and it will provide valuable theoretical information for better understanding of the innate immune signaling pathway and autoimmune disease.

STING是抗DNA病毒天然免疫系统中的关键蛋白，STING缺失会导致巨噬细胞天然免疫信号通路失活，而STING过度激活会导致严重的自身免疫病。目前调控STING活性的具体机制还不是很清楚。在筛选与STING有相互作用蛋白的过程中，我们发现NO信号通路蛋白SAP与STING信号通路交互调控：SAP可以负调控STING的抗病毒活性，并且影响STING信号通路中某些蛋白的定位；而STING信号通路中的磷酸激酶可以对SAP进行磷酸化修饰。由于NO作为免疫活性分子在巨噬细胞发挥其生物学功能的过程中有着重要的作用，因此，我们将进一步研究STING信号通路如何对SAP介导的NO信号通路产生影响，以及SAP蛋白磷酸化修饰对抗病毒信号通路以及NO信号通路是否会产生影响。我们的研究将对巨噬细胞中干扰素信号通路与NO信号通路的协调机制提供依据，为更好的理解天然免疫信号通路与自身免疫病提供有价值的理论信息。

STING作为抗DNA病毒天然免疫反应中的关键蛋白，它的活性调控对于激发抗病毒免疫反应和维持机体动态平衡具有重要的作用。本研究立项目的是筛选对STING活性具有调控作用的蛋白，进一步阐释STING活性调节的分子机制。通过前期筛选得到SAP（STING Associated Protein），即DDAH2蛋白。.经过我们的研究发现，DDAH2与STING、MAVS和TBK1均具有相互作用，免疫共沉淀及免疫荧光均显示其存在相互作用。提示DDAH2有可能参与调控STING/MAVS相关的信号通路；质粒过表达和RNAi干扰实验证实，DDAH2可以负向调控STING和MAVS介导的一型干扰素产生的信号通路。这些研究结果说明，DDAH2有可能通过影响STING/MAVS的功能，进一步调控其相关的信号通路。.在进行免疫荧光共定位实验过程中，我们意外发现，过表达DDAH2可以影响线粒体的形态；由于MAVS的线粒体定位对其发挥抗病毒免疫的功能十分重要，进一步的研究发现，DDAH2可以促进NO的产生，而NO可以引起线粒体形态的改变，导致MAVS不能正常的发挥信号转导的功能，从而阻断了MAVS介导的抗病毒信号通路。STING作为抗DNA病毒信号通路的接头蛋白，其主要定位在内质网及核周小体，目前我们暂未发现NO对内质网类的膜结构具有影响作用，因此DDAH2对STING负向调控的分子机制还在进一步挖掘中。.通过研究DDAH2与TBK1的相互作用，我们发现，TBK1可以对DDAH2进行磷酸化修饰，利用免疫共沉淀技术结合质谱分析的方法，我们发现DDAH2上有多个位点被TBK1磷酸化修饰；利用点突变技术对各个位点进行突变，检查DDAH2功能的变化，发现持续磷酸化可以抑制DDAH2产生NO的能力，说明TBK1通过对DDAH2进行磷酸化修饰，抑制其NO的产生能力。.此外，为了进一步检测DDAH2的生物学功能，我们构建了DDAH2基因敲除小鼠，并分别提取了MEF细胞、BMDM细胞，检测发现，与野生型细胞相比，DDAH2基因敲除的细胞在RNA病毒感染等刺激时可以产生更多的一型干扰素；利用野生型和DDAH2基因敲除小鼠进行活体实验，发现在病毒感染时，DDAH2基因敲除小鼠的存活率更高。.关于以上研究结果的论文已经撰写完成，正在进行论文投稿工作。