Bt蛋白与转Bt基因水稻内源蛋白的互作及其生物学效应研究

Transgenic crops can produce huge economic and environmental benefits, however, the safety problem is always the biggest restraining factor for the development of transgenic industry. As the exogenetic proteins expressed by transgenes, whether the transgene proteins interact with the endogenous proteins in transgenic organisms and further lead to unintended biological effects? The existing contents on safety evaluation of transgenic organisms have not taken the issue into account. In the proposed project, the transgenic Bt rice in different growth stages is chosen as the experimental materials to explore whether Bt protein interacts with the endogenous proteins in transgenic rice through the following steps. Step one, the co-immunoprecipitation assay is applied to search the endogenous rice proteins that interact with Bt protein, and then the protein mass spectrometry technology is used to identify the interaction proteins. Step two, the yeast two-hybrid assays are applied to confirm the ineractions between Bt protein and the identified rice proteins and find the interaction degree, and confocal laser scanning microscope is used to further confirm whether Bt protein and the identified rice proteins interact in tobacco leaf cells. Last step, the unexpected biological effects caused by the Bt protein-rice protein interactions will be explored through comprising the difference of the transcriptome and proteome and the stress resistance between the transgenic Bt rice and the parental rice. The project results will provide the theoretical basis for improvement of the biosafety assessment contents of transgenic organisms.

转基因作物虽然可以产生巨大的经济和环境效益，但是，安全性问题一直是转基因生物产业发展的最主要制约因素。国内外现有的转基因生物安全评价内容均没有考虑到外源基因表达的蛋白质是否会与转基因生物的内源蛋白质发生相互作用，并进而导致转基因生物产生非预期效应。本项目以不同生育期转Bt基因水稻为研究对象，首先通过免疫共沉淀技术和蛋白质质谱技术对与外源Bt蛋白发生相互作用的水稻内源蛋白进行大规模挖掘和鉴定，再通过酵母双杂交技术验证互作蛋白的真实性和互作强度，并用激光共聚焦显微镜观察烟草中Bt蛋白与特定水稻内源蛋白的互作，进一步验证互作的真实性。最后通过比较转Bt基因水稻与亲本水稻之间的抗逆性以及转录组和蛋白质组的差异，探索Bt蛋白与特定水稻内源蛋白互作可能产生的非预期生物学效应，为完善转基因生物安全评价的内容提供理论依据。

外源基因表达的蛋白质可能会与转基因作物的内源蛋白质发生相互作用，导致非预期效应和安全性问题的产生。本项目以不同生育期转Bt基因水稻Bt汕优63（Bt-SY63）及其常规水稻汕优63（SY63）为研究对象，开展了2个方面的相关研究。首先，利用中国农田开放式O3浓度升高（O3-FACE）研究平台，以Bt汕优63（Bt-SY63） 及汕优63（SY63）为试验材料，分别于处理26 d、47 d和75 d对其光合特性相关生理指标进行测定分析。发现随着O3处理时间的延长，Bt-SY63和SY63剑叶净光合速率（Pn）呈现下降趋势，与各自对照相比75 d时分别下降21.1%和15.1%（P＜0.01），气孔导度（Gs）和蒸腾速率（Tr）的变化趋势与Pn基本保持一致；PSⅡ最大光化学效率、PSⅡ实际光化学效率、光化学猝灭也表现出不同程度的下降；而两品种非光化学猝灭、吸收光能用于PSⅡ天线色素耗散的部分的变化则是处理高于对照；叶绿素以及类胡萝卜素含量也呈下降趋势，Bt-SY63可溶性蛋白含量在后期处理高于对照，核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）的含量未显著减少。O3浓度升高使Bt-SY63的光合特性相关指标都发生了不同程度的改变且变幅大于SY63，进一步表明外源Bt基因的导入引起转Bt基因水稻产生了非预期效应。其次，我们通过酵母双杂交技术对与外源Bt蛋白发生相互作用的水稻内源蛋白进行大规模挖掘、鉴定，发现了可能与Bt-SY63中的Bt蛋白发生互作的水稻内源蛋白主要包括参与抗性反应的互作蛋白、参与物质代谢的互作蛋白、参与氧化还原反应的互作蛋白3大类。根据前期研究中发现转基因水稻与非转基因水稻之间在抗逆反应和生长发育方面出现的非预期效应，我们选择了与抗逆和光合作用有关的水稻内源蛋白，使用酵母双杂交技术、免疫共沉淀技术、蛋白质质谱技术、激光共聚焦显微镜亚细胞共定位技术进行了互作真实性的验证，排除了部分假阳性的互作蛋白。最后通过比较转Bt基因水稻与亲本水稻之间的抗逆性以及转录组和蛋白质组的差异，探索了Bt蛋白与特定水稻内源蛋白互作可能产生的非预期生物学效应，为完善转基因生物安全评价的内容提供了理论依据。