miR-21在Cr(Ⅵ)诱导内质网应激反应性肝细胞凋亡中的作用及其机制研究

The hepatotoxicity caused by oral exposure to hexavalent chromium [Cr(Ⅵ)] has been an important issue in the field of toxicology. We have found that Cr(Ⅵ) induces L02 hepatocytes apoptosis through endoplasmic reticulum stress, which is accompanied with obvious decrease in expression level of miR-21 and the increase in mRNA and protein levels of programmed cell death 4 (PDCD4). It remains unknown whether miR-21 targets PDCD4 in Cr(Ⅵ)-induced cell apoptosis of the hepatocytes through endoplasmic reticulum stress. In the present study, we will analyze the effects of miR-21 on the functional activities and PDCD4 of hepatocytes after Cr(Ⅵ) exposure. Then, we will probe the relationship between miR-21 and ROS or endoplasmic reticulum stress in L02 hepatocytes exposed to Cr(Ⅵ). Next, we will conduct the mechanism study to check if miR-21 via PDCD4 inhibits the PI3K/AKT pathway, which leads to endoplasmic reticulum calcium imbalance involved in Cr(Ⅵ)-induced cell apoptosis. Finally, we will further unveil the role and mechanisms of miR-21 in Cr(Ⅵ)-induced hepatocytes apoptosis in vivo. This study is of great significance because it could provide novel epigenetic mechanism for Cr(Ⅵ)-induced acute hepatotoxicity and it would offer new targets for its intervention.

六价铬[Cr(Ⅵ)]经口进入机体导致肝毒性损伤是毒理学研究领域的热点问题。我们前期研究发现，Cr(Ⅵ)可通过内质网应激途径诱导L02肝细胞发生凋亡，并伴有miR-21的表达水平降低及程序性细胞死亡因子4(PDCD4)mRNA和蛋白水平增高。但是miR-21是否通过靶向调控PDCD4参与Cr(Ⅵ)诱导的内质网应激反应性肝细胞凋亡及其机制尚不清楚。本项目拟分析miR-21对Cr(Ⅵ)暴露的L02肝细胞功能活性和PDCD4的影响；研究Cr(Ⅵ)暴露的L02肝细胞中miR-21与活性氧(ROS)水平、内质网应激之间的关系；探讨Cr(Ⅵ)诱导L02肝细胞凋亡的机制是否与miR-21靶向调控PDCD4抑制PI3K/AKT信号通路导致内质网钙稳态失衡有关；体内验证miR-21在Cr(Ⅵ)致肝细胞凋亡中的作用及机制。本研究将为Cr(Ⅵ)致急性肝毒性提供新的表观遗传调控机理，并为其有效干预提供新的靶位。

六价铬[Cr(Ⅵ)]是化学性质最为活泼的Cr化合物，被广泛应用于工业生产中，通过含铬“三废”向环境中排放，对人类健康造成严重威胁。因此，探讨Cr(Ⅵ)引起细胞毒性的分子机制对其暴露的有效防制具有重要意义。目前人们认为Cr(Ⅵ)引起细胞内活性氧(ROS)的蓄积是其诱导细胞毒性的主要分子机制。内质网应激(ERS)及miRNAs作为近年来发现的与细胞损伤密切相关的调控机制，两者在Cr(Ⅵ)诱导毒性损伤中的作用及机制尚未阐明。本研究假设Cr(Ⅵ)暴露的L02肝细胞中，miR-21通过靶向调控程序性细胞死亡因子4 (PDCD4)抑制PI3K/AKT信号通路诱导ERS反应性细胞凋亡。在前期研究的基础上，首先以miRNAs在ERS介导的消化道肿瘤细胞凋亡中的作用进行综述，为探讨ERS及miR-21在Cr(Ⅵ)诱导肝细胞凋亡中的作用提供理论基础。利用Cr(Ⅵ)及ROS特异性抑制剂NAC处理肝细胞，检测细胞凋亡、线粒体功能及miRNAs等指标，结果表明Cr(Ⅵ)暴露可诱导线粒体损伤引起细胞内ROS的蓄积而抑制miR-21-5p的表达，降低的miR-21-5p对PDCD4的靶向抑制减弱进而调控Cr(Ⅵ)诱导的肝细胞凋亡；且利用Cr(Ⅵ)染毒miR-21-5p过/低表达的L02肝细胞株，发现miR-21-5p的表达降低可激活ERS中的PERK-CHOP信号通路诱导细胞凋亡的发生。研究还发现，Cr(Ⅵ)暴露可诱导细胞内ROS依赖的IP3R和RyR的表达，导致ER钙耗竭激活CHOP信号通路引起肝细胞S期阻滞。本项目进一步探讨长期低剂量Cr(Ⅵ)暴露对肝细胞的毒性损伤，结果显示Cr(Ⅵ)通过线粒体损伤引起细胞内ROS的蓄积，进而介导钙稳态失衡激活NF-κB信号通路诱导肝细胞早衰。此外，研究还证实线粒体功能异常与镉诱导的细胞凋亡及DNA损伤密切相关。本项目的研究结果表明Cr(Ⅵ)可通过ROS的蓄积引起miR-21-5p的表达改变、ERS、线粒体功能异常及钙稳态失衡等导致肝细胞毒性损伤。本研究提出了Cr(Ⅵ)诱导ERS反应性肝细胞凋亡中的表观遗传作用机制，首次证实miR-21-5p、ERS及线粒体功能异常之间的相互作用，进一步阐明了Cr(Ⅵ)暴露诱导肝毒性的毒作用机制，不仅为防治Cr(Ⅵ)暴露所致健康危害的生物预防提供新的靶点和科学依据，还为研究其他环境化学物诱导肝毒性的分子机制提供实验基础。