基于腺鳞生物学特性的荆芥功效物质单萜类成分生物合成关键酶基因功能研究

Volatile oil is the main effective substance of Schizonepeta tenuifolia Briq.. The glandular trichome is the important tissue for the synthesis and storage of volatile oil. It is also an important carrier of the quality and identification characteristic of Schizonepeta herba. However, the molecular mechanism of volatile oil synthesis in S. tenuifolia Briq. has not yet been revealed. In this project, the association of "peltate trichome-volatile oil-gene expression" was proposed, and the first P450 enzyme gene involved in the pathway of volatile oil biosynthesis in S. tenuifolia Briq. was screened based on single cell technique and transcriptome sequencing. We proposed to construct ST-L3OH yeast vector for in vitro enzyme assay, then construct silenced and overexpressed mutants of this candidate gene, compare wild-type materials with mutants about morphological characteristic, gene expression and metabolites by microscope, high-throughput sequencing and GC-MS, and systematically elaborate the biological function of the candidate gene in the biosynthesis of essential oil from S. tenuifolia Briq. Through this study, we constructed a genetic transformation system of S. tenuifolia Briq. , clarified the function of ST-L3OH gene, and analyzed the molecular mechanism of volatile oil synthesis in S. tenuifolia Briq. , so as to provide theoretical basis for revealing the quality formation of Schizonepeta herba.

挥发油是荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.主要药效物质，腺鳞是荆芥挥发油合成和储存的重要场所，是荆芥药材品质的重要载体，亦是中药鉴定的主要特征。但是关于荆芥挥发油合成的分子机制尚未揭示。本项目提出“腺鳞--挥发油--基因表达”的关联性，基于单细胞分析技术和转录组测序筛选参与荆芥挥发油生物合成路径上第一个P450酶进行功能验证。拟开展构建ST-L3OH酵母表达载体，进行体外酶促反应；同时构建该基因沉默和过表达突变体，对比野生型材料，进行形态学观察，利用高通量测序和气质分析技术对基因表达和代谢产物进行分析，系统的阐述该基因在荆芥挥发油生物合成中的生物学功能。通过本项目的研究，构建荆芥遗传转换体系，明确ST-L3OH基因的功能，解析荆芥挥发油合成的分子机制，为揭示荆芥药材品质形成提供理论依据。

薄荷烷类单萜是荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq.挥发油中的主要药效物质，其含量的高低是中药荆芥质量的评价关键因素。目前对于薄荷烷类单萜的生物合成研究主要集中在以薄荷为主的(+)-胡薄荷酮，但是关于荆芥中(-)-胡薄荷酮生物合成的研究基础非常薄弱。本项目基于前期积累的数据，开展了一系列原创性研究，在(-)-胡薄荷酮生物合成路径中取得重要进展。.本研究从荆芥中克隆得到柠檬烯-3-羟化酶的候选基因，并对其进行一系列生信分析及一系列生物学功能研究。StL3OH在荆芥不同部位和不同生长时期的表达规律与单萜类成分积累规律相一致。在酵母异源表达体系中，证实了StL3OH可以通过催化柠檬烯生成异薄荷烯醇。同时构建了VIGS-StL3OH瞬时表达植株，我们发现在StL3OH基因被沉默的突变体中(-)-胡薄荷酮的含量下降了8%，(+)-柠檬烯的含量上升了21%。本项目成功破解了(-)-胡薄荷酮生物合成路径上柠檬烯羟化酶的合成路径及关键酶基因，加深了对不同手性薄荷烷类单萜生物合成关键酶基因的了解。由于该步骤是柠檬烯合酶下游最关键的一步，羟基化的位置决定了下游产物的结构母核，因此该基因也为解析薄荷烷类单萜合成调控提供了方向。本研究过程中成功搭建荆芥体内功能基因研究体系，突破药用植物体内研究技术瓶颈，为唇形科芳香类药用植物的研究提供模式参考。本项目仍在进行过表达StL3OH以提高(-)-胡薄荷酮含量的代谢工程的研究，为将来的合成生物学和分子育种提供研究基础。.本项目超额完成任务，达到研究目标，已发表受标注的SCI论文7篇，其中国际合作发表3篇，最高单篇影响因子21.9，累计影响因子达61.26。