应用organoid疾病模型研究ASPM对神经发生的调控作用

Abnormal spindle-like primary microcephaly (ASPM), also known as the MCPH5 gene, is important for the normal function of the mitotic spindle in embryonic neuroblasts. The mutation of ASPM is the most common cause of the MCPH phenotype, which is a neurodevelopmental disease characterized by reduced head circumference, a significant decrease in size of cerebral cortex and at birth with variable degree of mental retardation. ASPM expression is maximal in the developing early embryonic brain in human. Recent studies have showed that ASPM is required for mitotic spindle orientation, cell division regulation, microtubule organization, ect. in cultured cells, suggesting ASPM may play an important role in neural stem cell/ neural progenitor cell proliferation and division. . However, little is known about the underlying mechanism through which human ASPM plays a role in neocortical neurogenesis. In this proposal, we will generate the hiPSC-derived three-dimensional organoids culture system to model features of human cortical development. Further experiments such as immunofluorescence, confocal laser scanning microscopy and high-resolution time-lapse imaging methods will be performed to investigate the functions of ASPM in neural stem cell/neural progenitor cell maintenance, proliferation, cell fate determination and corticogenesis. This research will provide a system for studies on the basic cellular mechanism of neurogenesis and cortical formation but also disclose pathological cellular foundation of microcephaly, which may open a new insight for the therapeutic researches on microcephaly.

ASPM是与纺锤体形成有关的蛋白质，参与有丝分裂过程中纺锤体功能的调节，在细胞分裂和细胞分化中发挥重要作用。ASPM基因在神经系统中表达丰富，基因突变导致的头小畸形综合征（microcephaly）是一种神经系统发育缺陷性疾病。MCPH病人出生时常表现为头围明显减小，并伴有不同程度的认知障碍。目前，由于实验动物模型的局限性，对于ASPM蛋白在人类大脑皮层神经发生中的具体作用机理所知甚少。本课题计划应用3D培养技术在体外诱导人源性iPSC细胞分化发育成类大脑皮层的organoids, 并应用免疫荧光、多光子显微镜成像和活细胞时序成像等技术来探讨ASPM在调控大脑皮层神经发生中的关键作用，揭示ASPM突变导致头小畸形的病理细胞学基础。

ASPM是与纺锤体形成有关的蛋白质，参与有丝分裂过程中纺锤体功能的调节，在细胞分裂和细胞分化中发挥重要作用。ASPM基因在神经系统中表达丰富，基因突变导致的头小畸形综合征（microcephaly）是一种神经系统发育缺陷性疾病。MCPH病人出生时常表现为头围明显减小，并伴有不同程度的认知障碍。目前，由于实验动物模型的局限性，对于ASPM蛋白在人类大脑皮层神经发生中的具体作用机理所知甚少。本课题计划应用3D培养技术在体外诱导人源性iPSC细胞分化发育成类大脑皮层的organoid。我们构建的3D organoid类皮层模型具有神经上皮样的结构特征，能够发育形成类似VZ和OSVZ的分区，能够维持vRG和oRG细胞的数量并且进一步分化迁移形成皮层不同片层结构区的成熟神经元，同时能够建立神经元之间的突触联系和神经网络。我们构建的3D organoid模型在一定程度上很好的模拟了人脑皮层早期发育特征，可以作为皮层发育的重要研究工具。因此，在此基础上我们应用ASPM头小畸形病人来源的iPS细胞培养出3D类皮层器官，研究头小畸形的细胞学改变。结果表明ASPM突变的organoid没有腔室样结构的形成，不能形成连续有序的极性神经上皮层，同时实验结果显示ASPM突变的vRG细胞分裂模式发生改变，不对称分裂增加，可能是导致vRG细胞数量明显减少而不能形成腔室样结构的原因。随着培养时间的延长，我们进一步发现在ASPM突变的organoid中没有形成明显的OSVZ区，oRG细胞数量明显减少，可能进一步加重了ASPM突变的organoid体积变小，这可能也是ASPM突变导致头小畸形的原因。皮层片层结构区的特异性标志物免疫荧光实验结果显示在ASPM 突变的organoid中尽管存在Tbr1+、Ctip2+、Brn2+、Satb2+、Reelin+表达的细胞，但是细胞排列紊乱，没有形成分层分区的皮层结构，这可能与早期神经前体细胞分裂形式改变有关。应用电生理和钙成像结果证明了ASPM突变的organoid中成熟的神经元数目明显减少，可能与早期发育中突变组只能形成较小的rosette有关，并且在突变组中的神经元存在神经环路功能缺陷，可能是导致ASPM病人认知迟缓的原因。因此，3D organoid类器官疾病模型将成为人类神经系统疾病研究的重要工具。