实时原位检测细胞表面RTK受体-生长因子配体分子识别行为的新方法研究

Receptor tyrosine protein kinase（RTK） is a transmembrane kinase protein receptor with tyrosine protein kinase（TPK） activity on intracellular part,which is one of the key kinases in cell signal transduction， can actuate the signal transduction by activating the active zone of its intracellular part resulting from the combination of its extrocellular part with its growth factor ligand. The molecular recognition behavior on cell surface between RTK receptor and its growth factor ligand will affect the activity of intracellular PTK, thereby affecting the signal transduction and biological functions. However, it is difficult to interpret the fine behavior changes between receptor - ligand molecular recognition by traditional biology methods, and more difficult to detect those in real time and in situ especially on the surface of live cells. Therefore, the project intends to fabricate new cytosensor for specificity , sensitivity, real time and in situ detection RTK receptor expression on cell surface and activity of PTK enzyme based on electrochemical and optical detection technology. Using SPM technique for single molecule & single-cell analysis, near field optical microscope combined with quantum dots marking technique can be used for single molecule near field optical imaging. Atomic force microscope is employed to explore the dynamic process of molecular recognition and single molecule force curve on live cells. It is conducive to reveal the micro dynamic process to obtain precise information of life process which the traditional method can't achieve. These studies are significantly important for indepth understanding the physiological function of RTK and PTK and the development of new drug screening method.

受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)是细胞信号转导进行的关键信号酶，细胞表面RTK受体-生长因子配体分子识别行为，将直接影响胞内激活酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性，进而影响其信号转导和生物功能。然而,传统生物学方法难以阐释这些受体-配体分子识别行为的精细变化，尤其在活细胞表面实时原位检测更是难以实现。因此，本项目拟构建细胞传感新方法，基于电化学和光学检测技术高特异性、高灵敏度、原位检测细胞表面RTK受体分子表达和胞内PTK酶分子活性；运用SPM技术进行单分子单细胞分析，以近场光学显微镜结合量子点标记进行单分子近场光学成像，探测细胞表面RTK分子表达分布情况；以原子力显微镜探测液体中活细胞表面分子识别行为及其动态变化过程，探测单分子作用力，通过图像重构和统计分析，在分子水平上揭示细胞表面这些受体-配体分子识别行为的精细变化及微观动态过程，对深入阐释细胞信号转导、调节机制和生物功能具有极其重要的意义。

受体酪氨酸蛋白激酶(RTK)是细胞信号转导进行的关键信号酶，细胞表面RTK受体-生长因子配体分子识别行为，将直接影响胞内酪氨酸蛋白激酶(PTK)活性，进而影响其信号转导和生物功能，它是目前药物筛选及癌症治疗研究重要靶点。然而,传统生物技术难以阐释这些受体-配体分子识别行为精细变化，尤其在活细胞表面实时原位高灵敏检测受体分子更是难以实现。因此，本项目发展了多种新型的细胞传感器原位研究细胞表面RTK受体分子及其识别行为，主要基于电致发光(ECL)、原子力显微镜(AFM)、石英晶体微天平(QCM)和荧光技术，结合多重信号放大策略设计纳米探针，构建了高灵敏度、高特异性细胞传感器，以RTK家族成员代表性分子表皮生长因子受体EGFR及其生长因子配体EGF分子识别行为作为研究模型，以乳腺癌细胞株为细胞模型，建立原位定量检测细胞表面受体分子新方法，率先建立同时检测细胞表面多种受体分子的ECL传感平台和单细胞分析平台，建立以单分子力谱AFM探测细胞表面受体-配体单分子识别、 QCM耗散因子研究细胞粘附和生物力学性质新方法，从全新的角度展现RTK受体-配体识别分子行为，进一步扩展研究其它细胞株和受体分子(如胰岛素受体),单细胞功能异质性(如CD44)、细胞间粘附(如E-Selectin)、药物调控细胞信号通路活性等。本项目率先对细胞RTK受体分子研究发展多种新分析方法，为医学基础研究更深入阐释疾病机理提供有力实验证据和有应用价值新技术。在项目基金资助下，本项目研究取得预期成果，已在国际刊物发表SCI收录论文37篇(通讯作者34篇),其中1区文章12篇（平均IF6.3),2区文章20篇(平均IF4.4),其它文章5篇，总引用次数294；申请发明专利2件；培养硕士生15名，博士生2名，获国家级奖学金4名；培养校级青年教师1名；项目负责人出访美国和澳洲进行访问和学术交流，发表国际合作文章3篇；参加本学科主要学术会议8次，分场报告3次。