基于内质网应激——未折叠蛋白质应答途径探讨宣肺醒脑法促进遗尿模型膀胱样cajal细胞凋亡的作用机制

Nocturnal enuresis is a common and chronic disease. The children may reduce the quality of life and have mental problems. TCM is superior to the drugs in nocturnal enuresis，but the therapeutic action of the herbs tonifying the kidney is not definite by systemically review. Releasing the lung and refreshing the mind is effective.The higher number of cajal cells in the bladder is a main cause of the unstable detrusor.. Yuebi Tang is used to study the cajal cells in the nocturnal enuresis. Changes of the function of the cajal cells will be detected on the level of cell, tissue, and in vivo after Yuebi Tang. Moreover, the amounts and micor structure of the cajal cells will be observed. We wish this study may be used to imply the effication of the detrusor instability and the cause of expelling the lung to therapy enuresis.

遗尿症是儿童临床常见病和慢性病之一，患儿若长期得不到诊治，将会降低其生活质量，影响儿童心理和人格的健康发展，其心理问题甚至会遗留终身。Meta分析结果显示，中医药相对阳性西药对于小儿遗尿症的疾病疗效、中医证候疗效方面有一定的优势，而单纯内服补肾类中药治疗此病的疗效并不确切。宣肺醒脑法是一种有效的方法。逼尿肌不稳定是临床最常见的膀胱尿道功能障碍之一，而膀胱中细胞数量的增多是引起逼尿肌不稳定产生的主要原因之一。本课题以越婢汤“宣肺醒脑”理论为指导，从内质网应激——未折叠蛋白质应答途径探讨越婢汤下调豚鼠逼尿肌不稳定膀胱ICC样细胞数量的相关机制，用免疫组化、免疫荧光、流式细胞等方法，测定ICC样细胞分布、超微结构和凋亡率等变化，以期探讨宣肺醒脑法对遗尿症逼尿肌不稳定膀胱模型的作用机制，从而对中医“下病上取”，以及“肺主治节”等理论作出现代实验科学的佐证。

项目背景：遗尿症是儿科常见病，发病率高。尽管其有自愈倾向，但是长时间得不到有效治疗，将会使小儿生活质量严重下降，同时也影响其身心健康。目前为止，遗尿的病因及相关作用机制尚不明确。现代医学以遗尿报警器和去氨加压素为主要疗效方案，但疗效仍不甚满意，复发率高。古今中医药学家多认为其病机是由于肾气亏虚，膀胱失约所致，多遵循温补收涩之法，用之应手而效者固多，然其效不显，或显效反复者亦为不少。本研究小组基于“提壶揭盖”之法，从肺论治，创“宣肺醒脑”之则，立“越婢汤”之方，收桴鼓之效。本课题研究内容主要包括两个方面：1. 越婢汤对膀胱 ICC 样细胞形态、增殖、及凋亡的影响 通过体外培养、纯化、鉴定膀胱 ICC 样细胞，采用 MTT 法测定 ICC样细胞增殖，电子显微镜观察超微结构变化，流式细胞仪检测细胞凋亡率变化。2.越婢汤对膀胱 ICC 样细胞内质网凋亡机制研究 测定和观察细胞内 ca2+浓度的变化；从转录水平，蛋白定量、蛋白定性的不同层次，分别测定了CHOP、calpain-2、ATF4、caspase-12、caspase-3 等内质网凋亡的三条途径相关蛋白因子。结果显示：1.越婢汤可以显著抑制Cajal细胞的增殖能力，但诱导细胞凋亡能力不足。2.越婢汤可以下调膀胱ICC样细胞数量，诱导ATF6﹑GRP78等促生存信号的高表达，进而调节膀胱不稳定状态所致的遗尿症。3.从中医“提壶揭盖”方向论治遗尿症的方法可行。其中关键数据提示：1.通过近端尿道结扎法建立了膀胱出口梗阻模型方法可行，并再次成功提取﹑鉴定了ICC样细胞。2.越婢汤可以显著抑制膀胱ICC样细胞增殖的能力，并导致细胞死亡，诱导ATF6﹑GRP78显著表达。科学意义：纵观内质网凋亡目标蛋白三个层次的检测结果，说明越婢汤在内质网应激-未折叠应答反应中，凋亡不是导致ICC样细胞数量减少的主要途径。根据结果，分析由于内质网应激之后的未折叠蛋白反应既可以引起凋亡，亦可导致自噬，且二者在信号通路上相互影响。故推测，造成ICC样细胞数量下调的原因，亦可能和自噬有关。