基于钙离子振荡介导下的内质网应激-自噬反应探讨“以俞调枢”法对Cajal间质细胞的调控效应机制

Cajal mesenchymal cells are the pacing cells of gastrointestinal motility, which play an absolute regulatory role in the function of gastrointestinal motility.Previous studies show that,the“Regulating the pivot through the shu points” method can improve Ren and Du Meridian by operation of the Qi, and by regulating the number of ICC cells and the expression of ultramicrostructure to improve the gastrointestinal motility function,but the regulation mechanism of ICC is unknown.Recent studies have found that the Ca2+ homeostasis in cells are disorder leads to endoplasmic reticulum stress autophagy and plays a dual regulatory role in the expression of cell number and morphology.On this basis, we speculate that“Regulating the pivot through the shu points” method is likely to improve the operation of the Qi on Ren and Du Meridian and influence endoplasmic reticulum stress - mediated autophagy Ca2+ oscillation reaction regulation effect on ICC, and then improve the gastrointestinal motility.To this end,the project team intend to further utilize modern technologies such as serum pharmacology,confocal microscopy and transmission electron microscopy to observe the infuence of IP3R/RyR mediated Ca2+ oscillation, endoplasmic reticulum stress - autophagy reactions/endoplasmic reticulum autophagy body expression and the ICC cell number/activity and morphological structure expression which after using the“Regulating the pivot through the shu points”method .And explore the correlation between the indexes in order to reveal the mechanism of "meridian-molecular" regulation effect of the treatment, enrich the connotation of the theory of Chinese medicine external treatment.

Cajal细胞(ICC)是胃肠平滑肌的起搏细胞，对胃肠运动起到绝对调控作用。前期研究表明，以俞调枢法能够改善任督二脉经气的运行，并通过调控ICC细胞数量和超微结构的表达起到改善胃肠动力的作用，但其对ICC的调控机制不明。新近研究发现，细胞内Ca2+稳态失衡会导致内质网应激-自噬反应并对细胞数量和形态结构的表达起到双重调控作用。据此我们推测以俞调枢法可能是通过改善任督二脉经气的运行影响了Ca2+振荡介导下的内质网应激-自噬反应对ICC的调控效应，进而改善了胃肠动力。为此，项目组拟在前期研究成果基础上进一步利用血清药理学、共聚焦显微镜、透射电镜等现代技术，观察以俞调枢法对IP3R/RyR介导的Ca2+振荡的影响、内质网应激-自噬反应/内质网自噬体表达的影响以及ICC细胞数量/活性和形态结构表达的影响，并深入探讨各指标之间的相关性，以揭示该疗法的“经络-分子”作用机制，丰富中医外治法的理论内涵。

前期研究表明，“以俞调枢”法能够通过改善任督二脉经气的运行，调控Cajal间质细胞(ICC细胞)的数量和超微结构的表达，进而起到改善胃肠动力的作用，但其对ICC细胞的调控效应机制不明。为此，本项目在前期研究成果的基础上，利用血清药理学、共聚焦显微镜、透射电镜等现代科学技术，通过在体实验和离体实验研究，观察了“以俞调枢”法对ICC细胞内IP3R/RyR介导的Ca2+振荡的影响、内质网应激-自噬反应表达的影响以及ICC细胞活性和形态结构表达的影响，并深入探讨了各指标之间的相关性。研究结果表明：①“以俞调枢”法能够抑制ICC细胞内质网应激自噬反应的发生，表现为定位蛋白CRT免疫标记的内质网自噬体数量显著降低，自噬相关蛋白FAM134B、LC3与CRT免疫荧光共定位及量的表达显著降低；②“以俞调枢”法干预后能够显著改善ICC的细胞活性，电镜下进一步观察ICC细胞的超微结构显示其细胞结构完整，细胞器较丰富，有较多的线粒体，细胞核及内质网的形态正常。③“以俞调枢”法干预后能够提高ICC细胞内钙离子、内质网钙离子的水平，提示其可能通过细胞内Ca2+浓度与内质网Ca2+浓度的周期性变化介导了ICC胞内内质网自噬的发生。④“以俞调枢”法干预后能够显著提高ICC细胞内质网钙离子通道蛋白IP3R、RyR蛋白的表达及IP3R mRNA、RyR mRNA的表达，提示其可能通过IP3R/RyR通道介导了胞内及内质网Ca2+的浓度发生了周期性振荡。⑤“以俞调枢”法能够抑制ICC细胞内应激蛋白GRP78及GRP78 mRNA的表达，抑制CRT、FAM134B、LC3蛋白及CRT mRNA、FAM134B mRNA的表达，提示其可能通过下调GRP78、CRT蛋白表达，抑制 FAM134B和LC3转位，进而有效调节内质网应激-自噬反应的发生。综上，“以俞调枢”法干预前后对IP3R/RyR介导的Ca2+振荡、内质网应激-自噬反应的表达以及 ICC细胞活性和形态结构的表达之间显示出了良好的正相关性，故我们推测“以俞调枢”法很可能是通过指针疗法作用于背俞穴所产生的物理效应，经得气后转化成相应的生物电信号或生化信号，影响了ICC细胞内钙离子振荡介导下的内质网应激-自噬反应的发生，从而实现对ICC细胞的调控效应并最终起到改善胃肠动力的作用。