盐藻重金属耐受相关基因的克隆与功能分析及其在重金属污染的植物修复中的应用

盐藻（Dunaliella）是一种生存于极端环境下的真核单细胞绿藻，对重金属具有很强的耐受性。本申请拟构建盐藻（D. viridis）的酵母表达文库，然后将此表达文库转化酵母重金属敏感突变体（Cd2+敏感突变体Δyap1、Cu2+ 敏感突变体Δcup1等），筛选突变表型回复的酵母转化子，通过酵母功能互补克隆盐藻耐受重金属相关基因。其次，在对所克隆基因进行序列分析的基础上，通过对其在酵母中进行功能域缺失和点突变分析、亚细胞定位研究及酵母转化子中重金属的含量测定，并结合原核表达蛋白对重金属的结合活性分析，研究所克隆基因耐受重金属的分子机理。最后，将盐藻重金属耐受基因遗传转化高等植物拟南芥和烟草等，筛选获得高耐、高积累重金属的转基因植株，应用于土壤重金属污染的植物修复。

本研究利用酵母Cd2+敏感突变体Δyap1对所构建的盐藻的酵母表达cDNA文库进行功能互补筛选，得到DvCRP1和DvCRP2这两个抗Cd2+基因，且该两个基因在已有公共数据库中均没有同源序列。过表达DvCRP1或DvCRP2均能显著提高酵母对Cd2+和Cu2+的抗性，并可增加酵母中的Cd2+积累。缺失和点突变分析表明，DvCRP1和DvCRP2蛋白的抗Cd2+功能结构域分别在N端和C端，且依赖其中富含半胱氨酸的关键基序。原核表达及体外生化分析显示DvCRP1和DvCRP2蛋白可以直接结合Cd2+。荧光定位表明DvCRP1和DvCRP2在酵母细胞中定位于细胞质及一些酸性囊泡中。RT-PCR表明DvCRP1和DvCRP2在盐藻体内的转录本水平均不受Cd2+或Cu2+诱导。Southern杂交显示DvCRP1和DvCRP2在盐藻基因组中分别为单拷贝和多拷贝。在洋葱表皮细胞中的瞬时表达说明DvCRP1和DvCRP2能正常表达并定位于细胞质中。对筛选到的转DvCRP1和DvCRP2纯合拟南芥进行Cd2+胁迫，结果显示目的基因高表达的株系，其地下部分对Cd2+的积累有所提高。