基于肝细胞色素P450酶表达调控的竹叶柴胡“疏肝解郁”物质基础及机理研究

This paper considers the activity and expression of P450 enzyme is closely related to the hepatic metabolism, and then proposed the hypothesis that the expression and regulation of P450 can evaluate the efficacy of “relieving-qi-stagnancy” from the connotation of TCM theory with modern pharmacology theory. First, to verify the hypothesis of the scientific nature, according to the consistency of the results of P450 activity between the drug group and the model group. Second, to establish a new method to evaluate the "relieving-qi-stagnancy" efficacy of Chinese medicine by determining the activity of enzyme and the expression of gene and protein by Cocktail, Real-time PCR and Western blotting. Then, we can use the above method to explore the effectiveness, the material basis and mechanism on B. marginatum in order to provide a reasonable basis of clinical use for ensure safe, effective, stable and controllable. It also can lay the foundation not only for the scientific evaluation of the medicinal value of other Bupleurum. plants but also for the resource development and utilization.

本课题在前期研究结果“竹叶柴胡地上、地下部分均可保肝，但物质基础不同”的基础上，从“疏肝解郁”的中医内涵出发，结合现代药理学理论，认为P450酶的活性与表达和肝的代谢功能密切相关，从而提出“P450的表达调控-疏肝解郁功效”假说。根据直接给药组与造模组对大鼠P450酶活性影响的一致性，验证该假说的科学性，采用cocktail、real-time PCR和western blotting法测定P450酶活性、基因和蛋白的表达量，建立一种评价中药“疏肝解郁”功效的新方法，以此法对竹叶柴胡及其所含不同大类成分进行功效评价，探索竹叶柴胡活性物质基础及作用机理。上述研究成果，将为西南地区习用竹叶柴胡安全、有效、稳定、可控的合理药用提供依据，为科学评价柴胡属其他植物的药用价值及资源开发利用奠定基础。

肝细胞色素氧化酶450（cytochrome P450，CYP450）存在于肝细胞内质网，是肝微粒体酶中参与多种内源性和外源性物质代谢的重要酶系。各类物质的代谢是肝脏主要的生理功能，这与 “肝主疏泄”的中医理论相类似。“肝郁气滞”是肝失疏泄导致的临床常见症候，治疗方法称为“疏肝解郁”。本课题基于现代药理学“肝郁气滞-内质网应激关联”学说，即“内质网应激”导致内质网中P450酶活性改变及表达异常，是“肝气郁滞”症候的亚细胞生理基础，提出了“P450酶表达调控-疏肝解郁功效”假说。.课题通过建立探针药物法（Cocktail）测定“疏肝解郁”经典方剂四逆散、药典品种柴胡及四川地区习用品竹叶柴胡提取液以及抑郁、肝损伤造模对大鼠肝脏CYP450酶5种常见亚型即CYP1A2、CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1、CYP3A4酶活性；建立荧光实时定量（Quantitative real-time PCR）法测定CYP1A1、CYP2C11、CYP2E1、CYP3A1的mRNA基因表达的影响。实验结果揭示中药 “疏肝解郁”的功效与大鼠CYP2C19、CYP2C9酶活性与表达量具有相关性，其分子机制可能与缓解内质网应激，诱导细胞内质网上CYP2C亚家族酶活性及表达有关；中药“疏肝解郁”功效还与CYP2E1酶活性与表达量的抑制有相关，其机制可能是抑制肝脏细胞脂质过氧化。采用Cocktail法分析竹叶柴胡不同提取部位对CYP2C19、CYP2C9、CYP2E1酶活性的影响，认为竹叶柴胡的黄酮类成分是其活性物质；并结合化合物的分离鉴定，建立了竹叶柴胡特征图谱及含量测定的质控方法。.研究结果初步验证了课题提出的“P450表达调控-疏肝解郁功效”假说，为评价中药“疏肝解郁”功效提供了一种新方法和新思路，为中药的合理药用提供科学依据，为科学评价中药药用价值及资源开发利用奠定基础。