Hedgehog/Gli1信号通路调节胶质母细胞瘤对替莫唑胺敏感性的实验研究

Currently, temozolomide (TMZ) is an agent of choice for clinical chemotherapy against human glioblastomas. However, its survival benefit remains unsatisfactory. Studies have shown that only about fifty percent of the patients with primary glioblastomas are sensitive to TMZ chemotherapy. The DNA repair protein O6-methylguanine-DNA methyltransferase (MGMT) plays a critical role in gliomas' resistance to TMZ by reversing the methylation at the O6 position of guanine in DNA induced by TMZ. Glioblastomas with high levels of MGMT are resistant to TMZ chemotherapy, which constitutes a major challenge in front of effective treatment of this disease. In our previous work, we have found that the expression of MGMT correlates with the activity of Hedgehog (HH)/Gli1 signaling pathway and that inhibition of the pathway results in a remarkable decrease of MGMT levels in glioblastoma cells. These findings suggest that the HH/Gli1 signaling pathway may be a potential target to overcome the chemoresistance related to high MGMT levels in human glioblastomas. In the current research, we will firstly investigate the relationship between the expression of Gli1, a key member of the HH/Gli1 signaling pathway, and that of MGMT in a series of surgically-resected glioblastoma samples.Then in glioblastoma cell lines and glioma stem cells, we will analyze the effects of regulating HH/Gli1 signaling activity on the expression of MGMT and the sensitivity to TMZ treatment. Finally in animal models, we will verify whether inhibiting the activity of HH/Gli1 signaling pathway will alleviate the chemoresistance to TMZ in glioblastoma cells with high MGMT levels. Taken together, the results from this research will shed light on effective therapeutic strategy against human glioblastomas with high levels of MGMT.

替莫唑胺是临床治疗胶质母细胞瘤的首选化疗药物，然而研究表明大约只有50%患者对其敏感，重要原因是肿瘤细胞内一种DNA修复酶MGMT能够修复替莫唑胺引起的DNA甲基化损伤，MGMT高表达的胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗耐药，是临床治疗中的难题。在前期工作中我们发现MGMT的表达与Hedgehog（HH）/Gli1信号通路的活性密切相关，抑制该信号通路后胶质母细胞瘤内MGMT表达水平显著降低，提示该信号通路可能与胶质母细胞瘤对替莫唑胺的化疗敏感性有关。本课题拟首先分析胶质母细胞瘤组织中Gli1与MGMT表达的关系，其次在体外培养的胶质母细胞瘤细胞和胶质瘤干细胞中研究调节HH/Gli1信号通路活性对MGMT表达和肿瘤细胞化疗敏感性的影响，最后在动物实验中观察抑制该信号通路的药物能否改善MGMT高表达的胶质母细胞瘤的化疗敏感性。本课题的研究结果将为治疗MGMT高表达的胶质母细胞瘤提供新的思路和方法。

胶质母细胞瘤是中枢神经系统恶性程度最高的肿瘤，即使综合使用手术、化疗和放疗等多种治疗手段，患者的平均生存期仅为12-15个月。化疗是治疗这一疾病的重要手段，替莫唑胺是临床治疗胶质母细胞瘤的首选化疗药物，然而研究表明大约只有50%患者对替莫唑胺化疗敏感，重要原因是肿瘤细胞内一种DNA修复酶MGMT能够修复替莫唑胺引起的DNA甲基化损伤，MGMT高表达的胶质母细胞瘤对替莫唑胺化疗耐药，是临床治疗中的难题。另一方面，胶质母细胞瘤中存在着一小部分干细胞样肿瘤前体细胞，这部分肿瘤前体细胞表达干细胞分子表面标记，具有MGMT高表达的特征，对替莫唑胺化疗耐药，是治疗后肿瘤复发的潜在原因，因此探索针对这类肿瘤前体细胞的有效治疗方法具有重要的临床意义。已有研究表明一部分胶质母细胞瘤中存在着异常活化的Hedgehog（HH）/Gli1信号通路，抑制该信号通路后胶质母细胞瘤生长明显受抑制，肿瘤前体细胞自我更新能力和成瘤能力减弱，显示出一定的靶向治疗作用。在本课题中，我们首先在手术切除的48例胶质母细胞瘤组织中分析了Gli1活性与MGMT表达的关系，结果显示Gli1细胞核染色阳性率与MGMT表达密切相关，提示HH/Gli1信号通路可能与MGMT表达有关。在体外培养的胶质母细胞瘤细胞系U87、U251和A172中，我们首先通过real-time PCR和Western Blot的方法检测了Gli1和MGMT的基础水平，结果显示A172细胞内两者均为低表达，而U251和U87内两者均为高表达。我们通过细胞转染的方法上调A172细胞内Gli1的表达，观察到肿瘤细胞内MGMT表达增加、对替莫唑胺化疗敏感性减弱；我们使用环巴胺抑制U251细胞内HH/Gli1信号通路活性后，观察到肿瘤细胞内MGMT表达减弱、对替莫唑胺化疗敏感性增加。我们使用染色质免疫共沉淀的方法检测到U251细胞内转录因子Gli1在MGMT基因启动子区域的结合位点。另外，在U87培养出的肿瘤前体细胞中，我们也观察到抑制HH/Gli1信号通路后MGMT的表达水平显著降低。最后，在使用U251建立的肿瘤体内模型中，我们观察到使用环巴胺抑制HH/Gli1信号通路可显著降低肿瘤细胞对替莫唑胺的耐药性，同时使用环巴胺和替莫唑胺治疗显示出协同抑制肿瘤生长的效果。本课题的研究结果将为胶质母细胞瘤的化疗提供新的思路和方法。