免疫应答中T辅助细胞分化的甲基化调控分子机制研究

At present, mechanism of DNA methylation control of lymphocytes , especially in T cell differentiation is becoming a hot issue. Preliminary study found that, the incidence of EAE was significantly reduced in methyl-CpG binding domain(MBD2) knock out mice (MBD2-/- mice),which were found significantly inhibition of TH17 function, indicating its relation with DNA methylation control of T cells differentiation. We analyze the differences in methylation of Th17 differentiation in MDB2-/- and WT mice by Medi-Solexa Sequence analysis, and comparative with Gene expression profiling. We found that more than 10 genes promoter region methylation regulated by MBD2，including in PTP1B，may be related to regulate Th17 differentiation and function. On this basis, we intend to study the mechanism of PTP1B promoter region methylation regulated by MBD2 and its regulation of CD4 + T cell differentiation to expressing IL-17 Th cell. We study the MDB2 and its downstream regulation of regulatory genes（ such as PTP1B ）influence on TH17 differentiation, IL-17 production by Lentiviral transfection and gene silencing in vitro. To study these genes influence on Th17-mediated rejection with cardiac allogeneic transplantation model in T-bet-/ - mice, bm12 mice. We can better understand the mechanisms of these gene regulation in T cell differentiation, and explore the mechanism of DNA methylation in T cell differentiation so as to find more effective therapy for prevention and treatment of immune related diseases.

目前，免疫细胞特别是T细胞分化的甲基化调控成为关注的热点。前期研究发现，甲基化相关结合蛋白2（MBD2）-/-小鼠EAE发生率明显降低，Th17功能明显抑制，提示Th17分化与甲基化调控相关。我们以Medip-Solexa甲基化测序分析MBD2-/-或wt小鼠Th17甲基化差异，并和其表达谱芯片比对，发现PTP1B等十余个基因启动子区域甲基化受MBD2调控，可能与Th17功能相关；在此基础上拟研究PTP1B等启动子区域甲基化受MBD2调控的机制及其在调控CD4+T细胞分化为表达IL-17的Th细胞中的作用。采用慢病毒转染、基因沉默技术在体外培养Th17分化中,研究MBD2或其下游调控基因如PTP1B等对Th17分化、IL-17产生的影响；以T-bet-/-小鼠、bm12小鼠的同种移植研究上述基因对Th17介导排斥反应的影响,为深入认识其调控T细胞分化机制寻找更有效防治免疫相关疾病提供思路。

免疫细胞的表观调控机制是近年来免疫学研究的新领域，深入认识免疫细胞调控新机制为进一步认识免疫细胞的活化、分化或耐受更有效地防治免疫性疾病提供了新的契机。我们的实验发现甲基化相关结合蛋白2（MBD2）缺陷可以抑制小鼠EAE的发生，提示MBD2可能参与了免疫细胞的分化调控并影响免疫相关性疾病的发生。本课题采用MBD2缺陷小鼠，研究MBD2的甲基化调控机制在T辅助细胞分化中的作用及其对移植排斥等免疫相关疾病的影响。通过四年研究发现， MBD2通过结合到DNA的甲基化CpG岛参与了多种免疫细胞的基因转录调控。1、MBD2可以结合T-bet启动子甲基化区域，调控T细胞分化；MBD2缺陷可以介导T-bet上调，导致Th细胞更多向Th1细胞分化，进一步减少了Th17细胞在总体细胞中的比例，提示MBD2可能在移植排斥中发挥作用。（2）采用同种心脏移植模型及慢性排斥模型，探讨了MBD2调控T辅助细胞分化的作用及其调控排斥反应的效果，发现以Rag1-/-小鼠为受者、Balb/c为供体同种心脏移植模型，回输MBD2-/-小鼠来源的Th17细胞的受者移植物存活期较回输MBD2+/+小鼠来源的Th17细胞显著延长；以T-bet缺陷小鼠为受者、移植bm12小鼠的心脏慢性排斥模型，发现回输MBD2缺陷小鼠来源的T辅助细胞后可较回输MBD2+/+小鼠T辅助细胞延长移植物的存活期；但以MBD2缺陷小鼠为受者、移植bm12小鼠心脏的慢性排斥模型中，发现其移植物的存活期较MBD2+/+小鼠体内缩短，提示MBD2调控排斥反应的不同效果及可能存在的复杂机制。3、在实验中我们观察到MBD2缺陷小鼠移植物病理炎症细胞特别是粒细胞浸润显著减少，结合移植物芯片及生物信息学分析，发现MBD2与免疫细胞趋化因子的表达调控密切相关。采用体内外实验，研究MBD2的生物学功能及分子机制，发现MBD2可以结合miR-106b-25簇中的CpG岛并调控其表达，进而调控Tak1与Traf3下游信号，调控免疫细胞如巨噬细胞多种趋化因子的表达，在免疫相关疾病中发挥重要作用。4、采用肝脏缺血再灌注介导的免疫损伤模型，发现MBD2缺陷可影响趋化因子显著减轻肝脏缺血再灌注介导的免疫炎症损伤，在天然免疫炎症反应中也发挥重要的作用。课题的研究结果为进一步深入认识MBD2调控免疫细胞的分子生物学功能及免疫相关疾病的防治提供了新的启示与实验证据。