BMP5—受体相关分子影响NSCLC细胞EGFR-TKI耐药的分子机制研究

Resistances to EGFR Tyrosine Kinase Inhibitors (EGFR-TKI) have frequently occured in NSCLC with EGFR mutation, while its molecular mechanisms are not clearly understood. Our data revealed that H1650 was more resistant to gefitinib than HCC4006 and HCC827, even through the three cells harbor a same EGFR mutation of 19 exon deletion. Thus, we proposed that there might be some other keys molecules or pathways which play key roles in EGFR-TKI resistance in a part of EGFR-mutated NSCLC cells. Analyzing the gene-expression profile we found that, BMP5 and related genes in TGFβ signaling pathway were up-regulated in H1650 than HCC4006 and HCC827. Furthermore, recombinant BMP-5 could stimulate the elevation of phospho levels of AKT and MEK in H1650. Thus, we proposed the following assumption: high expression of BMP-5 and its receptors in a part of NSCLC cells could activate key downstream pathways which maintain cell growth and survival through bypassing the EGFR signaling, and then lead to EGFR-TKI resistance. To uncover this assumption, this study will further exam the detailed molecular mechanisms between BMP5-receptors and EGFR-TKI resistance based on cytology and clinical specimin levels. The results are expected to provide novel evidence for individual treatment of EGFR-mutated NSCLC patients.

具有EGFR突变的NSCLC发生EGFR-TKI耐药的分子机制并不十分清楚。我们发现，携带相同EGFR激酶区突变类型的H1650与HCC4006、HCC827细胞对Gefitinib的敏感性相差近千倍。我们推测在某些EGFR突变的细胞中，存在某些分子/通路可以维持NSCLC细胞生长并导致对EGFR-TKI耐受。基因表达谱芯片数据显示，以BMP5为配体的TGFβ通路相关基因在H1650中显著高表达。体外实验也证实BMP5蛋白可以促进MEK和AKT磷酸化升高。据此，我们假设：BMP5及其受体分子在部分NSCLC细胞中高表达以维持细胞生长所依赖的关键信号通路，绕过EGFR等RTK通路的信号传导作用而使细胞对EGFR-TKI产生耐药。本项目将进一步从细胞学水平、临床样本水平深入细致地研究BMP5-受体通路与EGFR-TKI耐药的关系，并为EGFR突变的NSCLC患者的个体化治疗提供理论依据。

我们前期研究发现具有相同EGFR突变的不同NSCLC细胞，对EGFR-TKI的敏感性具有很大差异，但机制并不明确。本项目通过分析EGFR 19 Exon缺失的NSCLC细胞基因芯片数据，筛选出与 EGFR-TKI 敏感性相关的差异基因BMP5。但是，通过一系列实验证明BMP5—受体通路并不能显著促进细胞生长、存活，且与EGFR-TKI 耐药无显著关联。此外，BMP-5在NSCLC患者及健康对照组血清中的浓度也并无显著差异。在项目开展过程中，我们发现另一个细胞因子Epiregulin（EREG）能够显著促进NSCLC细胞对TKI药物的耐受性，因此及时对本项目的研究内容进行了调整。结果表明，EREG是通过抗凋亡而非促进细胞生长的方式，促进EGFR突变型NSCLC细胞对TKI耐受。为了研究EREG影响NSCLC细胞TKI耐药的分子机制，分别用shRNA敲降了ErbB 受体家族成员的表达。结果发现，当HER2表达被抑制后，EREG诱导的TKI耐受作用被削弱。免疫荧光分析提示EREG促进了EGFR和HER2异源二聚体的形成。我们还发现EREG的作用主要依赖于外源性，而内源性高表达EREG对NSCLC细胞TKI耐药没有显著影响。通过分析NSCLC肿瘤组织单细胞基因测序数据，发现EREG主要在肿瘤微环境中巨噬细胞中高表达。体外实验也证明EREG蛋白在巨噬细胞中显著高于其他细胞。我们用富含EREG的巨噬细胞上清液与NSCLC细胞共培养，可以显著提高后者对TKI的耐受性。最后，我们还通过分析基因表达谱数据，发现NSCLC 患者组织中EREG 高表达与 EGFR-TKI 治疗耐受和不良预后显著相关。本研究揭示了肿瘤微环境中EREG高表达促进NSCLC对TKI耐受的分子机制，该分子具有一定的临床指导意义。