应用非泛素化蛋白降解体系“ODC/AZ”靶向“敲减”胰腺癌细胞KRAS癌蛋白的研究

A naturally occurring alternative pathway for proteasome-dependent　protein degradation has been identified in ornithine　decarboxylase (ODC) and antizyme(AZ). ODC directly binds to and is degraded by the 26S proteasome　through a mechanism that is catalyzed by AZ and is independent　of ubiquitin. A technique named “Targeting Specific Proteins for Degradation” harnesses proteasome system to degrade the targeted proteins at the posttranslational level. In theory, expressing protein domain,such as binding domain, fused to ODC can promote proteasome-dependent degradation of these chimeric fusion proteins and their interacting cellular target proteins without the requirement for posttranslational modification with ubiquitin conceivably. Based on our previous research of “Targeted degradation of KRAS by an engineered ubiquitin ligase”, we plan to construct chimeric fusion proteins “RBD-ODC” in this study to “knockdown” KRAS oncoprotein in pancreatic adenocarcinoma independent of polyubiquitination. Moreover, the degradation mechanism of KRAS oncoprotein will be explored and the growth of pancreatic adenocarcinoma cells in vitro and in vivo will be observed, in order to remark the effectivity of “protein knockdown”by “ODC/AZ” system. Our study will expand the technique of “protein knockdown”. Maybe, as a new method for exploring the functions of genes or proteins, “Targeting Specific Proteins for Degradation”, combined with the technique of “gene-silencing”, will play an important role in basic and clinical medicine.

“鸟甘酸脱羧酶/抗酶（ODC/AZ）”体系中ODC直接与底物蛋白结合，在AZ催化下，被26S蛋白酶体识别降解。与“泛素-蛋白酶体”途径相比，该蛋白降解过程不依赖泛素化修饰，因此受影响因素少，作用更直接快速。“蛋白敲减”技术是应用蛋白被蛋白酶体识别降解的原理，在翻译后水平实现对蛋白的降解。理论上，将能够与底物结合的“结合结构域”同ODC融合表达，在AZ的催化下，应该可以实现不依赖泛素化修饰的蛋白降解。本课题在前期研究“靶向泛素化降解KRAS癌蛋白”的基础上，拟通过构建能与KRAS相互作用的“RBD-ODC”融合蛋白，在胰腺癌细胞内实现对KRAS不依赖泛素化修饰的降解，并通过体内外功能实验，检测其对胰腺癌细胞生物学特性的影响，评价“RBD-ODC”作为“敲减”底物蛋白工具的作用有效性。本课题的顺利开展将有助于丰富和拓展“蛋白敲减”技术的内容，为基因功能的研究以及基因治疗提供有意义的实验依据。

“蛋白敲减”技术是依据“泛素-蛋白酶体途径”（Ubiquitin Proteasome Pathway，UPP）特异性降解蛋白分子的原理发展而来。通过合理“结合结构域”的选择，“蛋白敲减”技术可以选择性地在翻译后水平直接降解相应蛋白分子底物，因此与传统的“基因沉默”技术相比，该技术具有更大的灵活性。但是不可否认，相比较于核酸分子单纯的一级和二级结构，蛋白质的空间构型要复杂得多。比如，E3泛素连接酶通过其三维空间构像与其底物分子形成复合物，二两者之间只有形成精确的空间几何结构，才能够使泛素结合酶E2催化泛素分子连接到特定底物的赖氨酸残基上，这就在一定程度上限制了通过泛素化途径进行“蛋白敲减”的应用。自然界存在可以不依赖泛素化的蛋白降解系统，即“鸟甘酸脱羧酶/抗酶”（ODC/AZ）系统。研究发现，ODC可以直接与相关的底物蛋白结合，其自身形成二聚体，进一步与抗酶AZ结合后，ODC蛋白构像被改变而直接被26S蛋白酶体识别、降解，这种蛋白水平的降解不需要泛素化修饰，因此受影响因素少，作用更直接快速。本研究在前期“靶向泛素化降解KRAS癌蛋白”实验的基础上，成功构建了“RC-ODC”融合蛋白，Western Blot结果显示，在人HEK293T细胞及胰腺癌PANC-1细胞中瞬时转染“RC-ODC”和AZ质粒后，能够在翻译后水平有效的下调外源性及内源性KRAS癌蛋白的表达水平，而蛋白酶体抑制剂MG-132可以抑制KRAS癌蛋白的降解，蛋白合成抑制剂放线菌酮则加速KRAS癌蛋白的降解。进一步体外和裸鼠体内的功能实验也显示，共转染“RC-ODC”和AZ后，胰腺癌细胞PANC-1的生长被显著抑制。该项目的研究结果为进一步探索“蛋白敲减”技术的应用价值奠定了一定的实验基础。