扁桃花芽抗寒性的生理与分子机制研究

本研究以新疆栽培扁桃和野扁桃为材料，通过野外调查和实验室测定分析相结合的方法，分别对野扁桃和栽培扁桃品种进行越冬后的花芽形态解剖和细胞学观察，并结合冬季气温变化情况分析种和品种的抗寒性差异；通过不同程度的低温胁迫处理，切片观察花芽的形态学变化，并测定胁迫下膜透性、可溶性糖、Pro、MDA、总蛋白等含量及POD、SOD、CAT活性的变化，分析扁桃花芽在胁迫条件下的生理响应机制。利用同源克隆的方法结合RACE技术，从低温胁迫的花芽中分离抗寒相关基因CBF，并应用半定量PCR分析其在不同程度胁迫条件下的表达情况。最后，把从扁桃中分离的CBF基因构建表达载体转化拟南芥进行抗寒性研究，结合荧光定量PCR技术，分析不同程度低温胁迫条件下，CBF的变化与其它耐寒基因COR等的关系，更加深入了解CBF在抗寒中的作用，进一步探讨扁桃抗寒性的分子机制。

本研究以新疆栽培扁桃和野扁桃为材料，通过野外调查和实验室测定分析相结合的方法，分别对野扁桃和栽培扁桃品种进行越冬后的花芽形态解剖和细胞学观察，并结合冬季气温变化情况分析了种和品种的抗寒性差异。通过不同程度的低温胁迫处理，切片观察了花芽的形态与抗寒性的变化，发现扁桃花芽抗寒性强弱与其花原基细胞纵横径大小、细胞排列紧密程度、细胞间隙大小密切相关；通过测定低温胁迫下膜透性、可溶性糖、Pro、MDA、总蛋白等含量及POD、SOD、CAT活性的变化，揭示了这些渗透调节物质和酶活性在扁桃花芽抗寒中的重要生理作用，并可作为抗寒性鉴定的生理指标。通过采用RT-PCR结合RACE方法，获得了全长为1171 bp的新疆野扁桃（Amygdalus ledebouriana Schlecht）抗寒基因，命名为AlsCBF（GenBank登录号为HQ908653），该基因ORF长713 bp，编码一个由237个氨基酸组成的蛋白。生物信息学分析结果表明，该蛋白分子量26.5581 kD，理论等电点6.76，为亲水性蛋白，位于细胞膜外，α-螺旋和无规则卷曲是AlsCBF的大量结构元件，而β-转角和延伸链则散布于整个蛋白质中。以新疆扁桃栽培品种米桑为材料，根据已经报道的Prunus dulcis CBF1基因序列设计引物，通过PCR扩增出开放阅读框为729bp的CBF1基因。 对其进行生物信息学分析，其与Prunus dulcis CBF1核苷酸及氨基酸序列同源性分别为99.73%和99.59%。通过从野扁桃中分离的CBF基因构建表达载体并转化烟草进行抗寒性研究，结合荧光定量PCR, 分析了CBF在不同时间段低温胁迫下的表达情况。结果显示AlsCBF基因的相对表达量在4℃处理24 h时达到峰值, 基因的表达量随胁迫时间的延长呈现先升后降再升的趋势。可以明显看出AlsCBF基因对温度变化敏感，当野扁桃在24 h处理条件下，AlsCBF基因迅速感应到低温伤害并大量表达。