利用CRISPR-Cas9和多肽自组装分析HIV潜伏储藏库

Developing an advanced method to image the gene of interest and its host cells is meaningful for exploring pathogenesis, monitoring disease progression, and evaluating treatment efficacy. In this study, based on the ability of CRIPSR-Cas9 system to target the gene of interest and the signal amplification mediated by peptide self-assembly, we devote to developing a novel method with high specificity and sensitivity to image HIV latent reservoir (HIV gene-integrated host cells). HIV latent reservoir is not susceptible to immune clearance and pharmacological treatment, thus causing a big obstacle to completely remove HIV from the body. The analysis against HIV latent reservoir is critical for guiding and evaluating HIV treatment. However, existing analytical methods against HIV latent reservoir (viral outgrowth assay, polymerase chain reaction/PCR) still have some disadvantages, such as the overlong detection period and the easy disturbance by free HIV in vivo. In comparison to these existing methods, our method might significantly improve the detection accuracy and shorten the detection period against HIV latent reservoir. Together, this study will better promote the understanding of HIV pathogenesis and viral progression, and optimize the parameters for evaluating treatment against HIV latent reservoir.

开发活细胞内基因成像新方法，建立针对目标细胞群体的分析体系，对研究疾病机理、监控病情、评价疗效均有重要意义。本课题旨在：利用CRISPR-Cas9系统的基因靶向功能和多肽自组装介导的荧光信号放大效应，开发一种高特异、高灵敏的活细胞内基因成像新方法，并应用该方法建立可快速、准确分析HIV潜伏储藏库的新分析体系。HIV基因整合进入宿主细胞基因组，形成HIV潜伏储藏库，是病毒无法清除的根源。分析HIV潜伏储藏库已成为研究HIV生理机制、制定治疗方案和评价治疗效果的前提和关键。但现有分析方法（病毒生长分析法、PCR方法）存在周期过长和易受干扰的缺点。我们希望通过本课题的研究，建立新的胞内基因成像方法，来系统性开展真实样本中HIV潜伏储藏库的体量大小、动态变化等一系列基础研究，为揭示HIV潜伏储藏库的形成机理、制定治疗方案、评价治疗效果提供科学依据。

HIV基因整合进入宿主细胞基因组，且功能保持静默，形成HIV潜伏储藏库，难以被免疫系统或者药物识别并清除，成为HIV病毒无法根除的原因之一。建立新方法，分析HIV潜伏储藏库的体量大小、动态变化等信息，成为研究HIV的生理机制、制定治疗方案和评价治疗效果的前提和关键。本课题旨在：利用CRISPR-Cas9系统中sgRNA的基因靶向功能和多肽自组装介导的荧光放大特性，发展细胞内基因成像新方法，用于HIV储藏库的分析。本人及课题组成员紧紧围绕本课题主旨目标，从以下3个方面开展了相关研究：（1）整体分析体系的模块化设计；（2）分析体系中相关模块（基因靶向、多肽组装、荧光成像等）的性能及机理的研究；（3）HIV潜伏储藏库分析。在“整体分析体系的模块化设计”方面：我们基于sgRNA对目标基因的靶向识别，酶促诱导的多肽自组装，荧光分子与自组装多肽特异性结合，设计构建了“靶向-组装-成像”体系，通过脂质体递送到胞内。在“分析体系中相关模块（基因靶向、多肽组装、荧光成像等）的性能及机理的研究”方面：我们采用已成熟的商业化sgRNA设计，重点研究多肽组装及其介导的荧光信号放大模块的设计构建及性能评价。如多肽序列长度、组成、驱动力、组装溶液体系等对多肽组装效率、组装速度、组装构象等核心组装参数的影响；评价了荧光分子与组装多肽结合后的信号增强，为进一步发展细胞内目标基因的成像新方法，完成了相关技术积累。在“HIV潜伏储藏库分析的整体性能研究”方面，我们构建了基于SHIV的非人灵长类感染动物模型（恒河猴），在单独鸡尾酒药物治疗、鸡尾酒药物结合治疗性疫苗治疗等多种组别中，从多个时间点动态评价了HIV潜藏库体量的发展变化。此外，我们还延伸发展了多种可有效放大读出信号的新技术，并探索和揭示了相关机理。总体来看，通过该项目的支持，我们在多肽组装驱动力分析、多肽组装体系的设计构建、分析方法的读出信号放大及其便捷读取等方面做了研究和验证，为本项目中分析方法的建立提供了机理解释和技术支持。