基于“络病”理论探讨壮骨方通过H型血管和成骨偶联干预糖尿病性骨质疏松的机制

TCM theory of ‘blood stasis’and ‘collateral disease’ are considered to be an important link in ‘Xiaoke-Gubi’. Recent studies have shown that diabetic osteoporosis (DOP) may be a microvascular disease. It is suggested that the central link of DOP may be osteogenesis-angiogenesis coupling. Subject pre-study confirmed that Zhuanggu Fang can reduce TNF-α’s level which was congsidered to be a vascular endothelial injury factor,and increase the level of IGF-1 as a vascular endothelial protective factor in DOP rats, improve osteoblast activity. Preliminary experiments have proved that the Zhuanggu Fang can improve the expression of type H vessels of femoral metaphysis in DOP rat. Then,We put forward a hypothesis that Zhuanggu Fang can promote osteoblast proliferation and regulation of DOP process by reducing TNF-α levels and improving IGF-1 levels, increasing the expression of type H vascular，further to interventing osteogenesis-angiogenesis coupling by Notch/Noggin/VEGF. The subject is to research the mechanism of osteogenesis-angiogenesis coupling in DOP. We take the Zhuanggu Fang as the study object,to further verify it’s effect in type H vascular and osteogenic coupling in DOP rats. At the same time, take the endothelial cells of vascular and osteoblast progenitor cells as the research emphasis to explore Zhuanggu Fang’s intervention mechanism through adjusting osteogenesis-angiogenesis coupling by Notch/Noggin/VEGF.

中医理论认为瘀血和络病是消渴骨痹发病的重要环节，且最新研究显示糖尿病性骨质疏松（DOP）可能是一种微血管病变，两种观点均提示成骨成血管偶联可能是DOP的中心环节。课题前期研究证实，壮骨方可降低DOP大鼠血管内皮损伤因子TNF-α水平，提高血管内皮保护因子IGF-1水平，改善成骨细胞活性，预实验也已经证实壮骨方可提高DOP大鼠股骨干骺端H型血管的表达。因此，我们提出“壮骨方通过降低TNF-α水平，提高IGF-1水平，增加H型血管表达，进而通过Notch/Noggin/VEGF干预成血管和成骨偶联，促进成骨细胞增殖，调节DOP进程”的假说。本课题开展DOP成血管和成骨偶联机制研究，以壮骨方为研究对象，进一步验证壮骨方对DOP大鼠H型血管及成骨偶联的影响，以血管内皮细胞及成骨祖细胞为研究重点，寻找壮骨方通过Notch/Noggin/VEGF调节成血管和成骨偶联的作用位点，探讨其干预机制。

中医理论认为瘀血和络病是消渴骨痹发病的重要环节，且最新研究显示糖尿病性骨质疏松（DOP）可能是一种微血管病变，两种观点均提示成骨成血管偶联可能是DOP的中心环节。课题组在前期研究基础上提出“壮骨方通过降低TNF-α水平，提高IGF-1水平，增加H型血管表达，进而通过Notch/Noggin/VEGF干预成血管和成骨偶联，促进成骨细胞增殖，调节DOP进程”的假说。首先，同时项目以糖尿病GK大鼠为研究对象，干预后采用micro-CT检测骨密度及骨结构，免疫荧光法检测大鼠骨组织中CD31、Emcn及Osterix表达，PCR及Western blot检测大鼠骨组织Notch1、Noggin、VEGF的mRNA及蛋白表达，证实了壮骨方可能通过Notch/Noggin/VEGF通路干预H型血管和成骨偶联，改善骨结构，提高骨密度，防治糖尿病性骨质疏松症。同时，项目以骨祖细胞为研究对象，干预后采用MTT法检测增殖，流式细胞术检测细胞凋亡，采用PCR及Western blot检测各组骨祖细胞VEGF表达水平；并将细胞进行成骨诱导及药物干预后，采用碱性磷酸酶染色、茜素红染色检测细胞成骨分化情况，采用免疫荧光法检测细胞Osterix表达水平；结果证实壮骨方能促进高糖环境下骨祖细胞增殖、抑制细胞凋亡，促进骨祖细胞成骨分化，并可能通过提高骨祖细胞VEGF水平促进血管内皮细胞增殖、分化。另外，项目以脐静脉内皮细胞为研究对象，干预后采用MTT法检测血管内皮细胞增殖水平，使用流式细胞术检测细胞凋亡水平，采用PCR及Western blot检测各组血管内皮细胞Notch1、Noggin的表达水平；结果证实壮骨方能促进高糖环境下血管内皮细胞增殖、抑制细胞凋亡，并可能通过提高血管内皮细胞Notch1、Noggin表达水平促进成骨分化。综上所述，本课题证实了壮骨方可通过调节骨祖细胞VEGF水平促进血管内皮细胞增殖、分化，并可通过调节血管内皮细胞Notch/Noggin促进骨祖细胞成骨分化，进而调控成血管和成骨偶联，促进H型血管生成及成骨分化，干预糖尿病性骨质疏松症进程。研究结果更加充实“消渴骨痹”中“络病”理论的病理学基础，也为中医药防治糖尿病性骨质疏松症提供了新的思路。