一个丝/苏类蛋白激酶HTA1调控植物ABA反应的分子机理研究

目前，植物ABA（Abscisic acid）反应中心环节的调控机理已经阐明，但是这一成果还不能用于指导分子育种实践，ABA反应的基因潜力仍需深入挖掘。为此，在拟南芥中进行了ABA反应突变体筛选。经过基因克隆发现ABA反应超级敏感基因-HTA1 （Hypersensitive To ABA 1） 编码一个丝/苏类蛋白激酶，体外可介导ABA反应调控因子-ABI5 （ABA Insensitive 5） 在新位点上发生磷酸化；沉默ABI5基因能够解除hta1-1突变体对ABA的超级敏感性，暗示HTA1很可能通过ABI5参与ABA反应，但其分子机制尚不清楚。本项目拟在此基础上，通过体内磷酸化、蛋白质相互作用与亚细胞定位、基因定点诱变与转基因表型分析等技术，阐明HTA1如何通过ABI5参与调节ABA反应，即揭示其分子机理。本项目有望为依靠改良ABA反应性状提高抗逆性的分子育种增添相关的知识储备。

植物激素ABA (abscisic acid)在植物生长发育和逆境胁迫应答中起着十分重要的作用。项目研究从两个PKS5 (SOS2-like protein kinase 5,项目申请阶段被命名为HTA1, Hypersensitive to ABA 1)激酶活性升高突变体pks5-3（FISL/NAF结构域内Ser-317->Leu-317突变,曾被命名为hta1-2）和 pks5-4（激酶活性活性结构域内Ala-168->Val-168突变，曾被命名为hta1-1）对ABA超级敏感的表型分析开始：发现PKS5能够与ABI5（ABA Insensitive 5）发生蛋白质-蛋白质相互作用，并且这一相互作用通过双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation）和荧光素酶互补实验（firefly luciferase complementation）得到验证；遗传分析表明PKS5在ABI5上游发挥功能；体外蛋白激酶活性和磷酸化位点克隆分析发现PKS5主要赋予ABI5第42位Ser残基磷酸化修饰；基因表达分析表明PKS5参与正向调控ABA应答基因的表达；免疫印迹实验分析发现PKS5赋予ABI5第42位Ser残基磷酸化修饰受到ABA诱导，并且这一位点磷酸化修饰能够激活ABI5转录功能；转基因植物表型分析发现携带ABI5/Ser-42->Asp（模拟磷酸化修饰状态）的转基因植物能回补abi5与pks5-4abi5对ABA不敏感的表型，而携带ABI5 Ser-42->Ala（模拟非磷酸化修饰状态）的转基因植物却不能回补这些突变体对ABA不敏感的表型；此外，通过体内ABA信号转导重建实验，初步确立了以PKS5—ABI5—AtEM6为基线的植物ABA信号转导途径。综上，本项目研究结果表明蛋白激酶PKS5通过磷酸化其互作因子ABI5参与调控ABA介导的种子萌发抑制以及ABA响应基因诱导表达过程。除此之外，我们还筛选得到了能够抑制pks5对ABA超级敏感表型的遗传修饰突变体6个并开展了初步功能分析，以及完成了对PKS5相关调节因子ABI5、ABI1、OST1等甘蓝同源基因的克隆与功能性分析，为项目的后续延伸与应用（依靠改良ABA反应性状提高抗逆性的分子育种）提供了理论依据和途径。