重组腺相关病毒（rAAV）介导CRISPR/Cas9技术靶向敲除雄激素受体（AR）基因治疗前列腺癌的实验研究

Prostate cancer is one of the most common malignancies among male population, it is also the second most diagnosed malignancy and fifth leading cause of cancer-related death. Many studies indicated that androgen receptor (AR) plays a very important role in prostate cancer progression, and the effect of AR deletion on tumor progression is largely unknown. Our preliminary data suggest that clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) associated nuclease 9 (CRISPR-Cas9) system can effectively delete AR gene. AR deletion significantly inhibits prostate cancer progression and downregulates the expression of its target genes in vitro. Furthermore, recombinant adeno-associated virus (rAAV) 7 can transduce human and mouse prostate cancer cells with high transduction efficacy and safety. This study will firstly package rAAV7-SaCas9 and sgAR viruses, and then the effect of AR deletion on survival rate of tumor bearing mice, tumor cell proliferation, apoptosis as well as tumor metastasis will be observed using transgenic adenocarcinoma mouse prostate (TRAMP) and xenograft mouse models. Simultaneously, the expression of AR target genes (SGK1/TMPRSS2) and tumor malignancy related genes will be detected. The activity of TMPRSS2/HGF/ MET/PI3K/SGK1/ERK1/2 will be evaluated. Taken together, our findings will provide critical foundation for investigating mechanism of prostate cancer progression and its gene therapy.

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，是全球范围内男性第二大被诊断和第五大致死性肿瘤。雄激素受体（AR）是前列腺癌进程的关键因子,敲除AR基因对肿瘤进程的影响仍未可知。我们的前期研究表明：1.CRISPR-Cas9系统可体外高效敲除肿瘤细胞AR基因，显著抑制前列腺癌进程，并显著下调AR靶基因表达水平；2.重组腺相关病毒（rAAV）7可高效安全转导人和小鼠前列腺癌细胞。本课题拟包装rAAV7-SaCas9和sgAR病毒，注射TRAMP小鼠前列腺（肿瘤）和裸鼠皮下移植瘤，分析肿瘤细胞内AR基因敲除对荷瘤小鼠生存周期，肿瘤细胞增殖，凋亡，转移等的影响。另外，检测AR靶基因（SGK1/TMPRSS2）及肿瘤恶性相关基因的表达变化，和TMPRSS2/HGF/MET/PI3K/SGK1/ERK1/2信号通路活性。研究结果将为前列腺癌基因治疗和分析前列腺癌发生发展的分子机制提供重要体内实验基础。

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，亦是全球范围内男性第二大被诊断和第五大致死性肿瘤。新型内分泌治疗药物（如阿比特龙和恩杂鲁胺）等上市后，为晚期转移性前列腺癌患者带来了曙光，但患者在接受药物治疗一定时间后会出现药物抵抗效应，导致肿瘤复发。雄激素受体（AR）突变或AR 剪接变异体或与激酶交联发生磷酸化而被激活是前列腺癌复发的主要因素之一，破坏AR表达成为前列腺癌有效治疗的首选方式，基于重组腺相关病毒（rAAV）递送CRISPR系统敲除肿瘤细胞中AR基因是实现该疗法的有效途径。.本项目包装AAV7型CRISPR/gRNA病毒，对10/24周龄TRAMP小鼠及VCaP裸鼠模型行前列腺原位或瘤内注射，分析肿瘤生长，远处转移和小鼠生存等情况，并阐释AR下游信号TMPRSS2/HGF/c-MET/PI3K/SGK1/ERK1/2活性，阐明AR敲除抑制前列腺癌进程的作用和机制。.课题组成功构建了rAAV包装所需质粒载体，获得高纯度病毒，rAAV-SaCas9/sgAR病毒注射组显著降低肿瘤细胞中AR表达水平，细胞凋亡显著增加，生存率显著高于PBS对照组。rAAV介导的PTEN和miR-34a过表达亦可显著抑制前列腺癌进程。为检验课题组包装rAAV病毒的质量和滴度，我们发现rAAV-EGFP病毒可在体外和体内有效转导心肌细胞。对8个随机对照试验（RCT）研究进行了meta荟萃分析，结果表明阿比特龙和恩杂鲁胺对前列腺癌的疗效确切，但在疲乏，背痛，高血压等方面表现有较明显副作用。另外，AAV7病毒注射后ALT/AST水平无显著差异，部分反映rAAV7病毒注射具有较高安全性，sgAR病毒注射组则未见明显远处转移灶，且AR敲除后，肿瘤细胞中的CCND1，SGK1和TMPRSS2表达水平也显著降低。此外，我们也关注到GSK-3β增加ROS的产生，从而诱导肿瘤细胞的氧化应激，而IL-8和mTOR通过抑制GSK-3β来减轻氧化应激，从而保护前列腺癌细胞。.rAAV-CRISPR系统可有效敲除肿瘤细胞内AR基因，无论前列腺原位注射还是肿瘤内注射均可有效转导该系统完成基因编辑，降低AR下游信号通路活性，显著延缓肿瘤细胞生长。我们的研究结果表明利用rAAV介导肿瘤细胞的AR敲除是阻抑前列腺癌进程的有效方式，为前列腺癌有效治疗提供了重要基础和依据，为前列腺癌患者带来显著生存获益。