CDR1应对CO2变化、调控保卫细胞运动的分子机制研究

The continued rise in therising atmospheric concentration of CO2 is predicted to have a significant impact on our ecosystem. For plants, CO2 is not only a substrate of photosynthesis but also a physiological environmental signal that regulates stomatal movements thereby controlling plant water relationship and carbon metabolism1. However, the mechanism underlying CO2 sensing and response in stomatal guard cells remains unclear. Using a combination of candidate gene approach and genetic screen, we isolated a T-DNA insertion mutant, referred to as cdr1 (Carbon Dioxide Resistance1), that grew more rapidly than wild type under high [CO2].The CDR1gene encodes a DTXs family member.The CDR1 is highly expressed in guard cells and localizes to the plasma membrane, implicating indicating a function in anion efflux that regulates stomatal aperture. Based on the reserch, we will subclone CDR1 and use TEVC or Gaint Patch Clamp to analyze its transport function in Xenopus Oocytes. The second, interact factors of CDR1 will be screened and identified from Yeast AD Liberary and comfirmed by BiFC or Co-IP. Finally, we will reconstitute a CO2 signaling pathway of CDR1 and its interactors.Trying to understand their regulation and provide a technical stock for CO2 increasing.

持续上升的CO2浓度对生态环境造成严重影响,CO2不仅是光合产物的原料也是调控保卫细胞运动维持水分和碳循环平衡的信号分子,保卫细胞感应CO2调控自身运动的分子机制一直是不清楚,揭示其感应、吸收CO2的机制是应对温室效应的紧迫的问题。近年来已发现控制保卫细胞运动的多种转运体，本课题组利用筛选候选基因家族突变体库，发现了CO2不敏感的特异突变体cdr1等、部分属于DTXs家族成员，定位于保卫细胞,具有阴离子转运活性，与激酶互作，本研究将以此为切入点，深入分析突变体参与CO2吸收的表型和生理活性，研究CDR1的转运调控特性，鉴定其介导的离子选择性、门控机理和对CO2的反应，进一步分离、鉴定CDR1转运体的调节或修饰分子，体外重组这些分子，解析其应对CO2、调控保卫细胞运动的分子途径，为植物应对温室气体的挑战提供技术储备。

大气中CO2浓度持续上升是人类面临的严重挑战，持续上升的CO2浓度预计会对全球气候、作物产量、植物生态系统和气体交换等产生诸多不良影响。CO2既是光合作用的底物，又是气孔运动的信号分子。项目综合采用分子遗传学和电生理学等技术手段，在以构建的膜蛋白T-DNA突变体库中，筛选获得了2个具有CO2不敏感特性的突变体（cdr1或 rhc1；cdr2 或 rhc2）。在本项目的支持下，经过详细和系统的解析，鉴定、确认了拟南芥CDR1(RHC1)为介导卤素元素的阴离子外排通道，这是一类全新的阴离子外运通道，被我们发现和命名。RHC1具有超极化激活的时间依赖性阴离子外排活性，进一步发现碳酸酐酶CA1和CA4能够与RHC1相互作用并通过其催化产物HCO3-增强RHC1的阴离子转运活性，另外，还发现HT1也能够与RHC1相互作用并磷酸化RHC1的C末端，rhc1/ht1-2双突变体与ht1-2单突变体具有类似的表型。用HT1作为诱饵蛋白筛选拟南芥酵母双杂文库，发现HT1能够与SnRK1.1相互作用，在非洲爪蟾卵母细胞中共表达HT1，SnRK1.1和SLAC1，发现HT1能够抑制SnRK1.1对SLAC1的激活作用，SLAC1处于关闭状态。因此，我们在体外系统中重组了RHC1介导的CO2信号途径：（1）在卵母细胞中共表达RHC1，HT1，SnRK1.1和SLAC1，SLAC1处于关闭状态；（2）共表达βCA4，RHC1，HT1，SnRK1.1和SLAC1，SLAC1处于激活状态；而（3）共表达βCA4，HT1，SnRK1.1和SLAC1，(缺失RHC1), SLAC1仍处于关闭状态；这证实了RHC1介导βCA4或βCA4的产物对SLAC1的激活作用，如果没有RHC1的参与，βCA4不能激活SLAC1 。另一组实验证了这一结论，即：不仅βCA4可以通过RHC1激活SLAC1，其高浓度产物HCO3-，可激活SLAC1，低浓度则无此反应，当RHC1不存在时，即使注入高浓度的HCO3-，SLAC1也不能被激活。项目证实了RHC1是保卫细胞CO2信号传导途径中HCO3-的感应蛋白，通过与HT1互作，解除HT1对下游元件SnRK1.1的抑制作用，使SnRK1.1激活SlAC1关闭保卫细胞。由此，本项目建立了一条保卫细胞内CO2信号感应、传导反应通路。