野生大豆耐盐碱关键基因克隆与功能分析

野生大豆具有很强的耐盐碱能力，是进行耐盐碱基因克隆和耐盐碱分子机理研究的理想材料。本研究以耐盐碱野生大豆为试材，在前期已构建的盐碱胁迫基因表达谱和基因调控网络的基础上，预测耐盐碱候选关键基因（hub基因）；对预测出耐盐碱候选关键基因采用real-time RT-PCR方法分析其表达特性；采用基于USER的高通量基因克隆和表达载体构建技术，克隆关键基因并构建植物表达载体，对关键基因进行遗传转化，采用floral dip法获得超表达拟南芥植株，利用农杆菌介导法获得超表达大豆植株，鉴定拟南芥突变体、筛选纯合突变体；对上述超表达植株和突变体植株进行盐碱胁迫处理、植株表型筛选和生理指标测定，鉴定并获得功能显著、拥有自主知识产权的耐盐碱新基因，为作物耐盐碱转基因育种提供重要基因资源，并为完善和补充植物耐逆分子机制提供实验证据。

项目的背景：本项目2012年获得资助，实施期为2012年1月至2015年12月，资助额度为60万元。项目的目的旨在针对黑龙江省乃至东北地区存在的重大问题——盐碱，以耐盐碱能力极强的野生大豆为基因克隆供体，基于前期已构建的盐碱胁迫基因表达谱和盐碱胁迫基因调控网络，进行了耐盐碱关键基因的克隆，并系统地进行功能验证，验证筛选功能显著、拥有自主知识产权的耐盐碱新基因，为作物耐盐碱转基因育种提供重要基因资源，并为完善和补充植物耐盐碱分子机制提供实验证据。.项目主持人认真组织实施，圆满地完成了预期目标，且大大超额完成了原计划的各项任务指标，详见正文中“原计划任务指标与实际完成任务指标情况对比表”。.主要研究内容、重要结果及关键数据：基于前期构建的基因调控网络，筛选确定了与盐碱胁迫相关的21个关键应答基因，包括5个转录因子基因6个蛋白激酶基因。.对21个基因进行了克隆和系统的功能验证。采用 floral dip 法获得超量表达拟南芥植株，利用子叶节法获得超量表达大豆植株，鉴定拟南芥突变体、筛选纯合突变体。对超量表达植株和突变体植株进行盐碱胁迫处理、植株表型筛选和生理指标测定，表达特性分析，耐盐碱功能分析等。.克隆验证了21个耐盐碱候选关键基因，其中16个在盐碱胁迫下功能显著、5个在干旱等胁迫下功能显著；完成了15个耐盐碱候选关键基因表达特性；获得4个转基因大豆新株系；共发表学术论文43篇，其中SCI论文21篇（累计影响因子68.863）；申报国家基因发明专利7项；获黑龙江省高校自然科学一等奖1项——“野生大豆盐碱胁迫基因调控网络构建及耐盐碱关键基因挖掘”；获“黑龙江省优秀研究生导师团队”称号。.科学意义：获得了一批功能显著、拥有自主知识产权的耐盐碱新基因，为培育耐盐碱作物转基因新品种，改良盐碱逆境生态区的生态环境，提供了重要基因资源，并为完善和补充植物耐盐碱分子机制提供了实验证据，具有重要的科学意义。