中国红豆杉细胞合成多乙酰基紫杉烷的代谢规律及调控机制

针对天然产物生物合成中代谢流难以定向调控的问题，选取典型的、可用旁路抑制策略调控目的物紫杉醇定向合成的研究体系- - 多乙酰基紫杉烷（MAT）代谢及调控为对象，以高产 MAT 的中国红豆杉细胞为材料，同时从基因和代谢物组2个层面探讨紫杉烷乙酰化代谢的规律和核心调控因素。先利用LC-MS、HPLC分析技术构建MAT 代谢产物组实时定量分析方法，考察代谢物组的表型，弄清MJ诱导后MAT在不同条件下的积累规律；然后利用GeneFishing技术，筛选MAT高产时的差异表达基因或片段；再在不同培养条件下，对代谢物组和相关初筛基因同时进行实时定量分析，反推两者的关系。通过以上研究，揭示不同培养条件下MAT与相关基因的变化规律及内在关联，明确部分基因在上调或下调MAT代谢旁路中的作用，进一步明确提出抑制紫杉醇MAT代谢旁路的调控措施，为实现目的产物的定向合成提供理论和实验依据。

天然产物的定向、高效生物合成是世界性的难题，其中产物羟化及后续的官能团化常导致产物的多样性流向。本项目针对的紫杉醇生物合成中的重要官能团化旁路MAT代谢网络调控问题，从代谢物和基因网络两个层面展开了研究。发展了LC-MS技术研究紫杉烷代谢物组的方法，深入挖掘中国红豆杉细胞转录组数据库，筛选了20个基因作为转录组分析的目标，包括已知紫杉醇合成羟化基因6个和酰化基因5个以及筛库获得的候选紫杉烷相关羟化基因4个、乙酰化基因5个。在茉莉酸甲酯（MJ）诱导下，发现紫杉醇组（TAX）细胞含量比MAT组提升更多，所选羟化基因表达总体提高的幅度大于酰化基因，说明羟化是产物多样性流向更重要的步骤。产物组的变化与所选基因的整体表达量密切相关（P<0.05），两组可以相互印证，相互支持；发现未知羟化基因OHX1和乙酰化基因ACX3 很有希望成为调控MAT合成的重要新基因。 对该细胞在不同溶氧条件下代谢物网络进行了组学层面的分析，发现低溶氧下，细胞通过增强糖酵解途径、降低TCA循环为萜类合成的甲羟戊酸途径提供更多底物，从而整体提升总紫杉烷的产量，TAX组产量的显著提升与紫杉醇羟化基因在低溶氧条件均有显著的表达呈对应，本项目为调控MAT最终提高紫杉醇的生物合成提供了新的视野。