补里透托法治疗糖尿病难愈性溃疡促血管新生的分子机制

Refractory diabetic ulcers seriously impacted on the patients' quality of life. Angiogenesis disorder is the major reason causing impairment of wound healing, however, there is no suitable treatment strategy. "Tuoli Xiaodu power" is a famous surgery prescription from "waike zhengzong". Our pre-clinical and experimental studies have showed that the active ingredient promoted endothelial cell proliferation and tube-like structure formation, and had a good therapeutic effect on the diabetic ulcers. However, the mechanism and characteristics remain unclear. Based on this, we proposed that therapeutic methods of Buli Toutuo can promote functional angiogenesis and then accelerate wound healing, and the method of Tuo and Tou can act on the key links of functional angiogenesis respectly. The refractory ulcers of the diabetic rat model and in vitro high glucose, hypoxia and stromal glycosylation cell model will be employed, immunofluorescence double labeling and western blot analysis, RNA interference will be used, to investigate the effect of therapeutic methods of Tuo and Tou on the key links of angiogenesis and glycosylation, to make clear the effect of the formulas of "Tuoli Xiaodu power" on the angiogenesis related Ang/Tie-2 signal, vascular remodeling related bFGF/PDGF signal and abnormal glycosylation signal,thus provide a further experimental basis on the therapeutical principle and methods of TCM of treatment of diabetic skin ulcers.

糖尿病难愈性溃疡严重影响着病人的生活质量，血管新生障碍是导致创面难以愈合的重要原因。托里消毒散是补里透托法的主要代表方剂，前期研究表明，其有效成分可促进内皮细胞增殖及管样结构形成，并对糖尿病难愈性溃疡有很好的治疗作用，但其机制及特点并不明确。基于此，我们提出"补里透托法可促进功能性血管新生而加速创面愈合，托法和透法方药可分别针对功能性血管再生关键环节发挥作用"的工作假说。本课题拟利用糖尿病大鼠难愈性溃疡模型及体外高糖、缺氧复合糖基化基质细胞模型，应用免疫荧光双标、western blot、RNA干扰等技术，考察透法和托法方药及其配伍分别对血管再生关键环节的影响，明确该法方药对血管新生相关Ang/Tie-2信号，血管重塑相关bFGF/PDGF信号及糖基化异常信号的影响，阐释补里透托法促进功能性血管新生的作用机制及特点。为中医药治疗糖尿病难愈性溃疡治法治则的深入研究奠定基础。

血管生成减少和炎症消散延迟是糖尿病难愈性创面的重要致病因素。中医治疗“疮疡”的代表性方剂托里消毒散包涵了中医“托”和“透”的治法，托法（黄芪、当归）流通气血，防止毒邪内陷；透法（白芷、皂角刺）透脓而载毒外泄，治疗理论切中糖尿病难愈性创面的病因，然而尚缺乏系统的研究阐明其作用及机制。本项目应用糖尿病大鼠皮肤创伤模型观察托里消毒散全方及其拆方托法和透法治疗糖尿病创面的效果，评估其对糖尿病创面血管生成及成熟、炎症消散等方面的影响，明确托里消毒散治疗糖尿病创面的作用靶点及托法和透法之间的协同作用；并通过内皮细胞、周细胞和巨噬细胞实验进一步探讨托里消毒散中各味中药发挥的作用。结果：1.糖尿病大鼠创面愈合明显延迟，托法和透法均可明显促进糖尿病大鼠的创面愈合，而全方组效果最佳；2.糖尿病大鼠创面血管生成明显减少伴血管成熟障碍，修复早期促血管生成因子表达减少，修复后期促血管成熟因子均表达下降，托法可明显增加创面促血管生成和成熟因子的表达；3. 托里消毒散中的各味中药成分可通过刺激内皮细胞和周细胞的增殖、迁移和成管，抑制周细胞的凋亡促进血管生成和成熟，以白芷和黄芪作用明显，其作用与激活ERK1/2 、PI3K/Akt、eNOS/NO信号通路有关。4. 糖尿病大鼠创面炎症消散延迟/炎症因子表达增加，透法明显促进创面炎症吸收、减少炎症因子表达。5.糖尿病创面炎症消散延迟与高糖氧化应激诱导巨噬细胞中NLRP3炎症复合体过度活化有关，透法中的白芷和皂角刺通过减轻氧化应激减少NLRP3炎症复合体的表达和活化，降低炎症因子的表达。本研究首次在糖尿病动物模型中证实了传统中药方剂“托里消毒散”促进糖尿病创面愈合的作用，并从现代医学的角度通过拆方研究初步阐述了具有代表性的中医治法 “托法”和“透法”的药理作用和可能的药理机制，发现托法通过上调促血管生成和成熟因子促进创面血管新生和成熟，透法通过抑制NLRP3炎症复合体改善创面炎症微环境，托法和透法联合后具有协同治疗效果。本研究为充实和扩展中医治法治则和传统中医药资源的发展和应用提供了科学可靠的依据