Kdm4b基因的甲基化编辑对滇南小耳猪体细胞核移植胚胎发育的作用机制

The previous of our study，the Differential Methylation Region (DMR) of the Kdm4b (lysine-specific demethylase 4b) was identified by WGBS of the Diannan Small-eared Pig somatic cell nuclear transfer embryos, this study aims to validate the function of Kdm4b gene in the development of Diannan Small-eared Pig somatic cell nuclear transfer embryonic by DNA methylation and demethylation editing based on CRISPR/dCas9. Methylation and demethylation vector are constructed，and gRNA expression vector is constructed on the basis of the DMR region of Kdm4b gene, these vectors are transcribed into RNA in vitro and then microinjected into somatic cell nuclear transfer embryos, and transplanted to receptor sows. We detect the whole genome methylation level of embryos, and the methylation, mRNA, protein expression of Kdm4b gene in embryos, fetuses and newborn piglets using RRBS (Reduced Representation Bisulphite Sequencing). qPCR, BSP (Bisufite Sequence PCR), and Western-blotting assay. The level of Kdm4b protein in different developmental stages of embryos was determined by immunohistochemistry. These studies elucidate the mechanisms of Kdm4b gene expression on development of Diannan Small-eared Pig somatic cell nuclear transfer embryonic, and provide scientific basis for reducing the mortality of Diannan Small-eared Pig somatic cell nuclear transfer embryonic.

课题组前期通过对滇南小耳猪体细胞核移植胚胎全基因组甲基化测序，确定了表观遗传调控基因Kdm4b的甲基化差异区域(DMR)，本研究拟通过基于CRISPR/dCas9的DNA甲基化及去甲基化修饰技术，验证Kdm4b基因在滇南小耳猪体细胞核移植胚胎发育过程中的功能。根据Kdm4b基因的DMR区域构建gRNA表达载体、甲基化载体和去甲基化载体，体外转录RNA并显微注射到体细胞核移植胚胎中，并将其移植到代孕母猪体内。利用RRBS、qPCR、BSP、Western-blotting等技术检测胚胎全基因组甲基化水平，以及胚胎、胎儿以及初生仔猪的组织和器官中Kdm4b基因的甲基化水平、mRNA和蛋白质表达水平，通过免疫组织化学方法测定Kdm4b基因在胚胎不同发育阶段的蛋白质表达量差异。以此阐Kdm4b基因的表达对滇南小耳猪体细胞核移植胚胎发育的作用机制，为降低滇南小耳猪体细胞核移植胚胎死亡率提供科学依据。

体细胞核移植技术在许多物种中获得了成功， 但效率却非常低，有超过90％的重构胚无法发育成个体， 大量的胚胎停滞发育是造成体细胞核移植效率低下的直接原因。本研究通过基于CRISPR/dCas9的DNA甲基化及去甲基化修饰技术，验证Kdm4b基因在滇南小耳猪体细胞核移植胚胎发育过程中的功能。构建了去甲基化载体pdCas9-Tet1和甲基化载体pdCas9-Dnmt3a；同时根据Kdm4b基因的甲基化差异区域设计了3个gRNA靶点，并分别构建了gRNA表达载体，通过检测证明3个gRNA在细胞内均有活性，且效率分别为41.2%，49.6%，60.1%；用RRBS（Reduced Representation Bisulfite Sequencing）方法分别检测2-细胞、4-细胞时期Kdm4b处理后的体细胞核移植胚胎和未处理的体细胞核移植胚胎，平均甲基化水平分别为0.41（2细胞）、0.44（4细胞），显著低于未处理组的0.53（2细胞）、0.58（4细胞）；囊胚率为24.32%，高于未处理组8.57%；通过分析体细胞核移植胚胎、Kdm4b处理后的体细胞核移植胚胎、受精胚胎体内发育和体外发育4组之间的差异表达基因情况，结果发现在这4组差异表达基因分析中，重叠的基因在2-细胞期有2个，为PRSS45和OR4B1，4-细胞期有4个，为SERPINF1、LOC110256677、VWC2L和STPG4，8-细胞期有3个RHOBTB1、LOC100522722和CHAC1，这9个基因可能是猪体细胞核移植胚胎早期发育中的关键基因。研究结果证明Kdm4b基因的表达对滇南小耳猪体细胞核移植胚胎发育状态的影响，并初步阐明了Kdm4b基因影响猪体细胞核移植胚胎早期发育的作用机制，为降低滇南小耳猪体细胞核移植胚胎死亡率提供科学依据。