microRNA-206对Cx43的转录后调控机制及其在乳腺癌转移中的作用研究

连接蛋白(Cx)43通过细胞骨架调节了乳腺癌远处转移,但是其转录后调控机制不清楚。我们前期研究发现，7种微小RNA（miR）具有与Cx43互补的基因序列，其中miR-206有2条互补序列；在乳腺癌向腋窝淋巴结转移中仅miR-206表达降低，与Cx43蛋白表达负相关；我们同时发现，miR-206通过抑制细胞丝足形成、抑制了乳腺癌转移。我们推测，miR-206是Cx43的调控因子。但是，miR-206调控Cx43的确切靶点，miR-206对Cx43的转录后调控是否通过细胞骨架调节了淋巴转移以外的乳腺癌转移，这些问题不清楚。本课题拟围绕上述问题，在前期研究基础上深入研究miR-206调控Cx43的组织细胞学基础和基因靶点，以及miR-206通过Cx43调节乳腺癌转移的分子机制，进一步利用乳腺癌转移小鼠模型研究转移规律和miR-206的治疗作用，为乳腺癌转移的防治和新药研制提供新的思路及实验数据。

微小RNA (microRNA，miRs) 和连接蛋白43（connexin 43，Cx43)参与了乳腺癌远处转移的调节，但是机理尚不明确。我们的研究发现，miR-1, miR-206, miR-200a, miR-381, miR-23a/b 和 miR-186可以抑制Cx43 的表达，乳腺癌的肝、肺转移灶中Cx43的蛋白表达明显高于原发灶；miR-206在肝、肺转移灶中的mRNA 表达较原发灶明显降低；降低MDA-MB-231细胞miR-206表达，Cx43的表达水平、细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著提高，增加MCF-7细胞miR-206表达后，Cx43的表达水平、细胞的增殖、迁移和侵袭能力均显著降低，miR-206与Cx43 mRNA、蛋白表达变化存在明显的负相关关系。miR-206可以使MCF-7细胞的Cx43表达明显降低，而对转染了Cx43编码区、缺乏Cx43 3’UTR的293细胞的Cx43表达无作用，miR-206可能是通过Cx43的3’UTR发挥作用；Cx43的3’-非翻译区（3’-untranslated region，3’-UTR）的位点478-484突变后，miR-206对Cx43的抑制效率降低了46.80%；位点1609-1615突变后抑制效率降低了16.72%；全部突变后抑制完全消失，表明miR-206调控Cx43是通过3'UTR的两个特定位点实现的。实验同时发现： miR-381 通过作用于促进子区域−500/−250抑制Cx43的表达，miR-381能够直接结合到3’-UTR 的CACUUGUAU序列，进而抑制C/EBPα (CCAAT/促进子结合蛋白 α) 的表达，C/EBPα 可以与Cx43基因中−459/−453位的标准结合元件AATTGTC结合；miR-381 通过C/EBPα和 Cx43抑制了乳腺癌细胞的转移，降低miR-381 的水平可以提高 C/EBPα 和Cx43的表达。与原发灶比较，乳腺癌转移组织中miR-200a是降低的，Cx43的表达是增加的，miR-200a 能够直接作用于Cx43基因的 3’-UTR，并抑制过表达Cx43所致的MCF-7细胞增殖活性的增加。综上所述，我们的实验揭示了miR-200a、miR-206和miR-381可能是Cx43的直接抑制因子，它们可能会成为诊断和治疗乳腺癌远处转移的目标之一。