靶向gyrA基因的反义肽肽核酸抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长

随着抗生素的广泛应用，多重耐药的鲍曼不动杆菌引起的感染呈快速增长趋势，抗生素治疗效果较差且易诱导新的耐药菌株，在免疫力低下的患者常引起严重的后果。沿循抗生素作用于细菌生长所必须的蛋白和酶的思路，采用反义技术抑制细菌生长的必须基因有望给多重耐药鲍曼不动杆菌的治疗带来新的突破。. gyrA编码产物为细菌拓扑异构酶Ⅱ，是细菌生长代谢所必须的基因，抑制其表达可有效地抑制细菌的生长甚至具有杀菌作用，是抗菌剂研发的良好靶标。肽核酸较传统的DNA更稳定，与靶DNA和RNA结合更牢固，与穿膜肽结合后能有效地透过细菌外膜和细胞壁障碍。体外试验显示出良好的靶基因抑制效果甚至优于抗生素的杀菌效果。本研究拟采用全长基因寻靶技术筛选出针对gyrA基因的高效反义核酸序列，合成肽肽核酸观察其在体外抑制多重耐药鲍曼不动杆菌生长的能力，为全新抗菌药物的开发提供新的思路。

年度计划完成情况.1.对临床分离的泛耐药鲍曼不动杆菌进行了鉴定，gyrA全长基因扩增和克隆，mRNA的体外转录和地高辛标记；.2. 联合应用二级结构预测软件设计了10条参数较好的反义寡核苷酸探针，以斑点杂交技术模拟体内环境进行了活性筛选。.3. 采用筛选到的序列合成肽核酸，并与穿膜肽连接形成PPNA，采用鲍曼不动杆菌泛耐药菌株CY-623作为试验菌株检测PPNA的体外抑菌活性和杀菌活性。.4.采用针对不同基因部位的PPNA联合应用观察有无协同作用。.5.观察PPNA抑制细菌的抗生素后效应。.6.观察PPNA作用细菌后其gyrA mRNA的表达情况，探讨其抑制细菌生长的机制。.7.增加了一条斑点杂交试验信号较弱的PPNA进行体外活性观察，以进一步论证体外斑点杂交试验筛选反义序列的可靠性。.二、取得的成果：.1.证实了采用计算机软件设计联合体外斑点杂交试验可模拟体内环境快速、高通量地进行高效反义序列筛选，其筛选效果与反义活性具有很好的一致性，为今后反义核酸的筛选建立了一个可靠的技术平台。.2.筛选到了在体外对多重耐药鲍曼不动杆菌具有明显抑制和杀菌活性的PPNA序列，最低抑菌浓度达5μmol/L，最低杀菌浓度10μmol/L，在2小时内即可发挥杀菌活性，错配序列的PPNA对细菌生长无明显抑制作用，说明肽核酸的反义抑制作用具有序列特异性，针对不同基因部位的PPNA联合应用只有相加作用而无协同作用。其抗生素后效应大于24小时，该反义PPNA的有效抑菌和杀菌浓度均明显低于国外的报道。.3.从全基因筛选的序列活性好于起始区设计的反义序列，说明在全长基因范围内筛选是必要的。.4.证明PPNA能有效降低靶基因mRNA的表达，证实了PPNA的反义作用机制。.三、论文发表、专利申请和人才培养.1.发表CSCD核心期刊论著2篇，SCI论文1篇已接受（Biological Molecular Report，接受日期2014-02-05）；.2.申请国家发明专利1项，已通过初审（专利号：201210251518.3）；.3.培养研究生3名，其中1名已毕业。