从AMPK/PPARα对心肌FFA代谢调控探讨坎离颗粒改善慢性心衰时心肌能量代谢的作用机制

KANLI granule has been demonstrated in the previous studies that it has the infection of decreasing myocardial FFA, promoting the gene expression of CPT-1 and improving the myocardial energy metabolism in chronic heart failure. Therefore, metabolism of myocardial fatty acid will be the target in the current stuy of heart failure model induced by aortic constriction, in which marks are including myocardial morphology index, myocardial FFA, plasma FFA , ATP and the change of AMPK/PPARα signaling pathway in the myocardial FFA metabolism. We will also expore the changes of above marks when AMPK and PPARα have been blocked through in-vitro cell culture experiments using myocardial cells of SD rat under the high FFA cultivation environment. This study will elucidate a new effect mechanism of KANLI granule in chronic heart failure to enrich and perfect TCM theory in this area.

本项目在前期研究发现心衰验方坎离颗粒干预压力负荷超载所致心衰大鼠具有降低心肌局部游离脂肪酸（FFA）浓度，增加CPT-1基因表达，改善心肌能量代谢作用的基础上，以心肌脂肪酸代谢为切入点，进一步探索慢性心衰时心肌能量代谢异常的调控机制以及中医药干预的影响。在体实验以腹主动脉缩窄致心衰大鼠模型为研究对象，对包括心肌形态学指标、血清及组织中FFA、心肌能谱及AMPK/PPARα/脂肪酸代谢途径关键环节指标等进行观察；离体实验以SD大鼠心肌细胞为研究对象，在高FFA培养环境下，观察AMPK和PPARα阻断后的脂肪酸代谢实验中上述指标的变化，进一步以坎离颗粒干预，研究该药对慢性心衰时心肌脂肪酸代谢异常的改善作用及其效应环节。本研究将对阐明中药坎离颗粒干预慢性心衰新的药效机制，探索中医药防治慢性心衰的新途径有重要意义。

腹主动脉缩窄32周压力负荷超载心衰大鼠模型造成了舒张性心衰模型，即收缩功能保存的心力衰竭（EFNHF），并伴收缩功能代偿性增强；在结构上存在心肌重构，其特点为心肌间质胶原增加为主的心肌肥厚，心肌收缩单位的丧失和心肌僵硬度增加，无明显心肌细胞肥大。这些心肌结构和功能的改变伴随着心肌能量产生减少。坎离颗粒的干预，改善心肌适应性肥厚，心肌细胞数增加直接导致心肌产能增加，从而改善模型鼠左室舒张功能：使左室压力负荷减轻和舒张末压降低，使心肌收缩单位增加和舒张性能改善，其中以坎离中剂量组疗效最明显。坎离颗粒干预可显著改善该心衰模型心肌能谱，同时改善心肌适应性肥厚和左室舒张功能；能谱的改善与该药物改善模型鼠心肌重构和舒张功能有一定相关。脂肪酸代谢途径相关基因和蛋白表达研究显示模型组大鼠心肌SCAD、CPT-I、PPARα基因和蛋白表达显著下调坎离颗粒可以上调上述基因和蛋白的表达，这可能是坎离颗粒改善心肌能量代谢的可能机制。细胞实验结果提示，应用10uM AMPK阻断剂Compound C、1uM PPARa阻断剂MK886后FFA的吸收和利用受损，坎离颗粒可增加FFA的吸收与利用。分别给予AMPK阻断剂Compound C和 PPARa阻断剂MK886后心肌能量代谢受损，ATP降低，加用坎离颗粒（50ug/ml）后ATP增加，其中Compound C变化更显著。给予在外源性性FFA刺激下，脂肪酸代谢相关CPT-1、SCAD、PPARa基因和蛋白表达增加；坎离颗粒并不能进一步增加正常心肌脂肪酸代谢相关因子的表达；应用AMPK阻断剂Compound C和PPARa阻断剂MK886处理后，再给予脂肪酸刺激，脂肪酸代谢相关因子表达不能相应增加，脂肪酸代谢受损；而加用坎离颗粒可以增加脂肪酸代谢相关CPT-1、SACD、PPARα的蛋白和基因表达；无论是阻断AMPK还是阻断其下游的PPARα，均能使其下游相关蛋白表达增加，提示了坎离颗粒多靶点的作用机制，应用AMPK阻断剂后显著抑制了AMPK的磷酸化，坎离颗粒增加抑制状态下的AMPK磷酸化，提示脂肪酸代谢过程中AMPK磷酸化起关键作用。