AP-2γ基因在睾丸生殖细胞瘤发生中的分子作用机制研究

AP-2γ是睾丸肿瘤的特异表达的新分子标记，但迄今为止具体的遗传分子机制还不清楚。前期运用CHIP的方法，鉴定到多个受AP-2γ调控的靶基因。通过对靶基因的启动子区序列的分析，在其中6个基因的启动子区发现了完整的AP-2γ结合位点核心序列。本项目拟采用CHIP-on-chip方法进一步筛选AP-2γ的下游调控网络；染色质免疫沉淀及报道基因构建等技术探讨AP-2γ 是否通过与上述相关基因启动子区的结合而直接调控其转录活性；并采用凝胶阻滞实验、突变质粒构建、基因转染、Western印记、supershift及免疫共沉淀等技术，研究AP-2γ在睾丸生殖细胞肿瘤发生过程中的诱导作用及可能参与的OCT4-SRY-KAP1复合体调控途径的分子机制。本研究将阐明AP-2γ基因在睾丸生殖细胞肿瘤发生中的分子机制，对基因诊断并最终利用分子干预手段治疗睾丸生殖细胞肿瘤相关疾病提供理论基础。

AP-2γ基因是睾丸生殖细胞瘤发生的新分子标记。通过对AP-2γ基因进行生物信息学分析，发现在AP-2γ的上游启动子区域有转录因子OCT-4和SRY的结合位点。通过ChIP-PCR实验，我们首先证明OCT-4和SRY都能够结合到AP-2γ的启动子区域。荧光素酶实验结果表明OCT-4能够负调控AP-2γ转录活性，SRY正调控AP-2γ转录活性。下调OCT-4后AP-2γ的荧光素酶表达活性和蛋白水平均能上升；下调SRY表达，导致AP-2γ的荧光素酶表达活性和蛋白表达水平均下降；免疫荧光实验表明，NTera-2细胞内中SRY和OCT-4蛋白分别与AP-2γ在细胞核中有共定位；构建小鼠的隐睾动物模型，我们发现正常小鼠睾丸中Oct-4高表达，AP-2γ低表达；而在小鼠隐睾中Oct-4低表达，AP-2γ却表达上调。我们还证明SMAD4是AP-2γ的靶基因，AP-2γ负调控SMAD4基因的表达。.研究表明阿司匹林、姜黄素可诱导乳腺癌、肝癌等多种癌症细胞发生凋亡，但是二者在人类睾丸生殖细胞肿瘤治疗方面的研究报道却很少。在本研究中，我们通过Hoechst 33258染核、流式分析法等检测阿司匹林或姜黄素对睾丸生殖肿瘤细胞株NTera-2的凋亡影响；采用MTT法检测对NTera-2细胞增殖的影响。研究结果表明，阿司匹林处理后能够促进NTera-2细胞的凋亡、抑制NTera-2细胞的增殖。Caspse8活性检测显示随着阿司匹林的浓度增强caspase8活性增强；阿司匹林诱导后, Western blot检测，FasL表达明显下降， caspase8表达和活性上升都是剂量和时间依赖性的。caspase3前体的表达减少，表明其剪切体活性增强而使细胞凋亡。姜黄素处理NTera-2细胞后可以抑制其增殖并诱导细胞凋亡发生，而且这种细胞凋亡现象具有时间和剂量依赖性。不同剂量的姜黄素处理细胞后， Bcl-2在蛋白水平下降，同时Bax的表达上调，且Cyt-C，Caspase-9，Caspase-3，Caspase-8和PARP均被激活。AP-2γ的表达随着姜黄素剂量增加呈现下降趋势，且其蛋白降解是通过蛋白酶体途径进行的。姜黄素诱导NTera-2细胞凋亡和抑制增殖是通过抑制AP-2γ蛋白调控的下游信号通路。