混合碳源强化生物食品防腐剂ε-聚赖氨酸合成的生理过程机制

ε-poly-L-lysine (ε-PL) has not been produced and used as an effective food preservative in our country derived from the low productivity of ε-PL-producing strain. To the best of our knowledge, metabolic engineering is an efficient strategy for enhancing the productivity of ε-PL-producing strain. However, the exploitation of key metabolic nodes in the pathway of ε-PL requires a comprehensive understanding of the process of ε-PL synthesis. We have improved ε-PL production using glucose-glycerol mixed carbon sources fermentation strategy by Streptomyces sp. M-Z18, and found that mixed carbon sources fermentation could significantly reduce fermentation time by 20.2% and 25.8% than glucose and glycerol as single carbon source, respectively. Meanwhile, ε-PL productivities were also increased by 89.2% and 35.2%. It is indicated that M-Z18 makes a significant physiological and metabolic changes during mixed carbon sources fermentation process. To understand these changes, the effect of mixed carbon sources on intracellar energy, key genes expression and metabolic flux were investigated by the combination of chemostatic culture, quantitative real-time PCR and 13C metabolic network analysis. The mechanism presented here not only gain improved insight into Streptomyces physiology of carbon source utilization, but also may provide a novel strategy to acquire the desired ε-PL-producing strain by metabolic engineering.

国内ε-聚赖氨酸（ε-PL）产生菌发酵水平偏低是制约其在国内工业化生产和应用的关键因素之一。代谢工程是改造其合成能力的有效手段。然而,ε-PL合成途径中哪些代谢节点是限制其合成能力提升的关键位点尚缺乏全局性和机理性认识。申请人在利用Streptomyces sp. M-Z18以葡萄糖-甘油混合碳源发酵生产ε-PL过程中发现：葡萄糖和甘油能够协调同步利用；且混合碳源较葡萄糖和甘油发酵时间分别缩短20.2%和25.8%，ε-PL合成速率相应提高89.2%和35.2%。为阐明M-Z18在混合碳源发酵时的生理变化，本课题利用恒化培养、实时定量PCR和13C代谢网络分析等研究策略，从能量水平、基因表达水平和代谢通量层面，解析混合碳源调控M-Z18强化ε-PL合成的生理过程机制。研究结果有助于增加对链霉菌利用混合碳源的理解，并为利用代谢工程手段改造ε-PL产生菌提供理论指导，具有重要的理论和实践意义。

项目针对ε-聚赖氨酸（ε-PL）产生菌—小白链霉菌（Streptomyces albulus M-Z18）发酵葡萄糖和甘油两种碳源生产ε-PL时，表现出两个有趣且有重要工业应用价值的现象：（1）葡萄糖和甘油能够被同步协调利用；（2）混合碳源发酵时间较葡萄糖和甘油单一碳源分别缩短20.2%和25.8%，开展了葡萄糖-甘油混合碳源强化小白链霉菌合成ε-PL的生理机制研究。得到如下结论：.（1）S. albulus M-Z18具备同步利用葡萄糖和甘油的生理基础：基因转录水平分析，发现混合碳源培养的细胞中负责葡萄糖和甘油转运的基因转录彼此未受到抑制，表明S. albulus M-Z18不存在典型的葡萄糖效应。另外，借助转录组学分析和辅助碳源添加实验，发现并证实了单一碳源发酵时，S. albulus M-Z18细胞潜在需要另一种碳源参与代谢，而葡萄糖和甘油的同时存在迎合了细胞的自身需求。.（2）混合碳源是通过加快菌体细胞的基础代谢来实现ε-PL合成强化：通过发酵过程参数、关键酶活性、胞内辅因子分析发现，混合碳源发酵中，EMP途径、TCA循环和DAP途径关键酶活性均获得提升，胞内ATP和NADH水平也获得增加，菌体实现了快速增加；基因转录组学分析表明，混合碳源发酵增强了细胞组分合成、TCA循环、回补途径、DAP途径和细胞电子传递链、ATP合成酶等基因的转录水平；基于恒化培养（0.05 h-1）的代谢流分析，也发现了双碳源发酵中细胞在EMP途径、TCA循环、回补途径和DAP途径上具有更大的代谢通量。.（3）混合碳源在分批发酵阶段积累的大量ROS是造成补料阶段代谢性能衰退的主要因素：通过分析混合碳源补料分批发酵参数，并监测发酵过程细胞生理状态，发现混合碳源分批发酵后期细胞的生理参数已经发生了衰退，导致ε-PL合成能力快速下降；通过监测发酵中细胞的氧化胁迫状态，发现分批发酵阶段高强度的呼吸代谢产生了大量ROS且抗氧化酶系受到损伤；进一步分析与氧化应激相关的基因转录水平，发现混合碳源发酵培养细胞中与氧化胁迫和应激相关基因获得了高表达。. 上述研究成果，初步阐明了链霉菌同步利用葡萄糖和甘油的生理代谢机制，为人们现有认知链霉菌代谢碳源的方式提供了重要补充；同时，也为利用代谢工程和生化工程手段解决补料阶段发酵优势性状消失提供了理论指导。