辅因子ATP调控小白链霉菌高效合成ε-聚赖氨酸的生理机制研究

Epsilon-poly-L-lysine (ε-poly-L-lysine, ε-PL) is a novel and natural food preservative, and its biosynthesis requires large amounts of ATP. In our previous study, a mutant named Streptomyces albulus R6 was obtained by multi-stage mutagenesis, genome shuffling and ribosome engineering. Whereas, the insufficient supply of intracellular ATP is one of the key bottlenecks restricting the further improvement of ε-PL production. Recently, a pH control strategy was established to improve the intracellular ATP supply, which significantly enhanced the ε-PL synthesis rate (by 50%-205%) in the middle and late fermentation stages. However, effects of intracellular ATP levels on the regulation of ε-PL and major by-products metabolism still require comprehensive understanding. To elucidate the physiological mechanism of ATP regulating efficient synthesis of ε-PL by Streptomyces albulus, genetic engineering will be applied to increase the intracellular ATP supply. Meanwhile, iTRAQ analysis, qRT-PCR, 13C metabolic network analysis will also be used to analyze the process mechanism of ATP regulating the efficient synthesis of ε-PL by Streptomyces albulus, from energy, protein and metabolic flux levels. This study is helpful for deeper understanding of the regulation of ε-PL synthesis by ATP, while providing theoretical guidance for further regulation of intracellular cofactors by metabolic engineering.

ε-聚赖氨酸（ε-PL）是一种新型天然的食品防腐剂，其生物合成需大量的ATP。项目组前期经多级诱变、基因组改组与核糖体工程选育获得突变株Streptomyces albulus R6，其胞内ATP供应量不足是限制ε-PL产量进一步提升的关键瓶颈之一。申请人建立了能增加胞内ATP供应量的pH调控策略，显著提升了发酵中后期ε-PL的合成速率（50%~205%）。然而，胞内ATP水平对ε-PL和主要副产物的代谢调控尚缺乏全局性和机理性认识。为阐明ATP调控小白链霉菌高效合成ε-PL的生理机制，申请人拟利用基因工程的方法提高ATP供应量，同时借助iTRAQ相对定量蛋白组学技术和13C代谢网络分析等策略，从能量水平、蛋白水平、代谢通量层面解析胞内ATP调控小白链霉菌高效合成ε-PL的过程机制。本研究有助于加深ATP调控链霉菌合成ε-PL理解，并为利用代谢工程手段对胞内辅因子进行精深调控提供理论指导。

本项目以前期获得的一株ε-聚赖氨酸(ε-PL)高产菌S.albulus WG608为研究对象，通过构建ATP再生系统，获得了一株胞内ATP供应增加的ε-PL高产突变菌。基于生理学，转录组、蛋白组及基因工程的方法，考察了高产菌与原始菌的代谢差异，揭示了ε-PL高效合成与调控的生理机制并挖掘了大量潜在高产关键元件。随后，通过对高产菌的代谢工程改造以及发酵策略优化进一步提高了ε-PL的产量。主要结论如下：.（1）ATP是限制WG-608的ε-PL合成的关键因素，其供应量的提高可以显著提升小白链霉菌的ε-PL产量。与出发菌相比，PL05摇瓶发酵中的胞内ATP含量增加了71.56%，同时ε-PL产量达到2.34±0.09 g/L，比WG608提高了21.24%。.（2）ε-PL的高效合成与调控机制：与原始菌相比，ε-PL高产突变株的糖酵解途径、PPP和乙醛酸循环被上调，为ε-PL前体L -赖氨酸的合成提供了足够的还原力(即NADPH)和草乙酸盐。氧化磷酸化途径被上调，增加了ATP供应，以催化更多的L -赖氨酸合成ε-PL。上调的MtrAB促进DNA合成，随后增强了转录和翻译过程，从而使WG-608的ε-PL生物合成能力更强。MprAB和PepD的表达上调，正向调控了sigE和sigB的转录，从而进一步激活ε-PL合成酶的转录，促进了ε-PL的合成。此外，脂肪酸、支链氨基酸(如L-组氨酸、L-色氨酸、L-缬氨酸和L -亮氨酸)和一些次级代谢副产物(如两性霉素B、制霉菌素A1、海马霉素、candiidin D、海马霉素内酯和杆菌素)的生物合成途径在转录和蛋白表达水平均被下调，从而为ε-PL的合成和代谢流的重定向节省了能量和前体。同时，WG-608对不良胞外条件的耐受性也得到增强。转录调控因子VanJ和VanS的上调增强了WG-608的耐药性。谷氨酸脱羧酶体系的上调，L-精氨酸、L-谷氨酸、L-天冬氨酸和L-赖氨酸浓度的增加，提高了WG-608的耐酸性。这些结果揭示了WG-608在低pH和高ε-PL浓度环境下持续大量生产ε-PL的原因。.（3）建立动态pH调控策略有助于进一步提高胞内ATP含量和ε-PL产量，并研究了高产机制。最终ε-PL产量在5 L规模发酵达到70.2 g/L，较出发菌提高了56%。.本项目对揭示ε-PL合成调控的分子机制有重要意义，同时也为开发先进的ε-P