E3泛素连接酶相关基因LZTR1在胶质瘤发生发展中的功能及分子机制

The successful application of bortezomib in the treatment of cancer research driven by proteasome inhibitors, especially for the development of highly selective E3 ligase targeting drugs become the focus. LZTR1 as a new E3 ligase, exhibits a high frequency of deletion and mutation in glioma. In our results of previous studies, the mRNA expression level of LZTR1 was down-regulated in human gliomas cases compared with normal brain tissues, and LZTR1 suppressed the glioma cell growth. Further studies have shown that it regulates the stability of RIT1 protein through the ubiquitin proteasome pathway, suggesting that LZTR1 may be involved in the regulation of MAPK pathway by RAS family members, and plays an important role in the development of cancer. Therefore, this project aims through various molecular biological means to find and identify possible substrates for ubiquitination, elucidating LZTR1 via the ubiquitin proteasome pathway of glioma signaling regulation; and in animal models (including subcutaneous tumor experiments and gene knockout mice), to observe the effect of abnormal expression of LZTR1 on tumorigenesis and nervous system in vivo. Thus systematic, comprehensive state LZTR1 in the mechanism of cerebral tumorigenesis of glioma, and provide new clues or targets for the treatment of glioma.

硼替佐米在肿瘤治疗中的成功应用带动了蛋白酶体抑制剂的研发，尤其针对E3连接酶开发高选择性靶向药物成为焦点。LZTR1作为新发现的E3连接酶，在脑胶质瘤中呈现高频缺失和突变。我们的前期研究表明LZTR1的mRNA表达量显著低于正常脑组织，且随着肿瘤级别的升高显著性增加；LZTR1可以显著抑制细胞的增殖。进一步机制研究表明其通过泛素蛋白酶体途径调控RIT1蛋白的稳定性，提示LZTR1可能通过RAS家族成员参与调控MAPK通路，在肿瘤发生发展中起重要作用。因此，本课题在扩大样本验证的同时，拟通过各种分子生物学手段寻找并鉴定可能的泛素化底物，阐明LZTR1通过泛素蛋白酶体途径对重要胶质瘤信号通路进行调控；并在动物模型（包括裸鼠和基因敲除小鼠模型）水平上观察LZTR1异常表达后对体内成瘤及神经系统的影响，从而较深入、全面的阐明其在胶质瘤发生过程中的作用机制，为脑胶质瘤的治疗提供新的思路及分子靶标。

LZTR1为脑胶质瘤驱动基因，在GBM中高频突变及缺失，其发生杂合性缺失的频率高达22.4%，发生编码区错义突变的频率为4.4%。但是目前为止，还未有研究揭示脑胶质瘤驱动基因LZTR1在脑胶质瘤发生发展过程中的功能及机制。.本研究首先采用实时荧光定量PCR的方法验证了LZTR1在脑胶质瘤样本中显著下调表达，且其表达量随着脑胶质瘤级别的升高而降低（P=0.0066）。.接着我们从泛素化的角度出发对LZTR1基因的致病机制进行深入的研究。我们首次筛选及鉴定到了LZTR1的泛素化修饰底物RIT1，结果显示，LZTR1作为Cullin3-RBX1泛素连接酶复合物的底物接头蛋白通过Kelch结构域识别RIT1并对其进行泛素化修饰继而通过泛素蛋白酶体途径导致RIT1蛋白的降解，并且LZTR1脑胶质瘤相关的大部分突变体都丧失了其对RIT1的识别、泛素化修饰及降解的功能。此外我们发现，LZTR1及RIT1可以调控MAPK信号通路上MEK、ERK以及下游丝裂原应激活化蛋白激酶MSK1的磷酸化水平，而MSK1的磷酸化与多种脑功能密切相关。.进一步对LZTR1及RIT1进行细胞功能学方面的研究，我们发现过表达LZTR1以及消减RIT1后抑制了脑胶质瘤细胞的增殖，S期细胞比例显著降低，抑制了细胞的迁移；并且消减LZTR1后出现的细胞表型可以被消减RIT1所回复，提示LZTR1在脑胶质瘤中的功能是依赖于其泛素化修饰底物RIT1的。另外，在裸鼠脑胶质瘤原位成瘤实验中我们发现，过表达LZTR1后可以显著抑制脑胶质瘤细胞系U87-MG原位成瘤的能力，裸鼠的生存期显著延长；相反，过表达RIT1后显著增强了U87-MG细胞系原位成瘤的能力，瘤体生长速度显著加快且裸鼠生存期显著缩短。LZTR1及RIT1过表达或消减后对脑胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响，结果显示LZTR1的过表达或RIT1的消减都会显著增加脑胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。.综上所述，本研究首次筛选并鉴定到了脑胶质瘤驱动基因LZTR1的泛素化修饰底物RIT1，并且首次阐明了LZTR1及RIT1在脑胶质瘤发生发展过程中的功能，系统地解释了LZTR1高频突变及缺失导致脑胶质瘤发生的分子机制，为脑胶质瘤的机制研究及临床治疗提供了新的理论基础及分子靶标。