组蛋白去乙酰化酶6调控纤毛自噬在炭黑颗粒致气道重构中的作用机制

Carbon black particle is one of the most serious pollutants in workplace and living environments, which could give rise to carbon black pneumoconiosis and other respiratory diseases characterized by ventilation dysfunction and early pathological feature of airway remodeling. It has been shown that abnormal structure and function of respiratory tract cilia can induce airway remodeling, but the exact mechanism is still not clear. In this research, considering HDAC6 and ciliophagy as a breakthrough point, the techniques of gas-liquid interface culture, Western blot, PCR, immunohistochemistry, light microscope and electron microscope are applied to analyze the dose- and time-effect relationships between carbon black particles and the levels of HDAC6 and ciliophagy on bronchial epithelial cells, and observed the role of HDAC6 siRNA intervention on the recovery effect of cilia structure. Meanwhile, mice exposure model is established through disposable tracheal instillation to explore the mechanisms of ciliophagy regulated by HDAC6 in airway remodeling induced by carbon black particles. Furthermore, the optimal point of blocking HDAC6 would be selected by comparing the specific intervention effects of HDAD6 in different pathological stages of cilia and airway structures before and after exposure to carbon black particles. The research would provide innovative target to prevent and treat respiratory diseases associated with ventilatory dysfunction induced by carbon black particles.

炭黑颗粒作为工作场所和生活环境中重要污染物之一，长期接触可引起炭黑尘肺，还会导致多种以通气功能障碍为特征的呼吸道相关疾病的发生与发展，而气道重构是其共有的早期病理特征。研究显示呼吸道纤毛结构及功能的改变可诱发气道重构，但具体作用机制尚不清楚。本研究以HDAC6及纤毛自噬为切入点，拟采用气液交界面培养法、Western blot、PCR、免疫组化、光镜及电镜等方法，从体外细胞实验分析炭黑颗粒诱导支气管上皮细胞产生HDAC6及纤毛自噬的剂量及时间效应，观察HDAC6 siRNA的干预对恢复纤毛结构的作用；通过一次性气管滴注炭黑颗粒制备小鼠染毒模型，探讨HDAC6调控纤毛自噬在炭黑颗粒暴露致气道重构中的作用机制；并通过比较特异性HDAC6抑制剂对染毒前后纤毛及气道结构改变的干预效果，分析预防和控制炭黑颗粒诱发气道重构的最佳作用点，为早期防治炭黑颗粒致呼吸功能障碍性疾病提供新的靶点。

炭黑颗粒（CB）是由含碳化合物不完全燃烧所产生的低溶性颗粒物，是工作场所和生活环境中的重要污染物。长期接触CB可导致以肺功能下降，可引起炭黑尘肺、慢性支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺部疾病等多种通气功能障碍的呼吸系统疾，但具体机制尚不完全清楚。本研究以CB为受试物，16HBE细胞、6-8周龄C57BL/L雄性小鼠为研究对象，采用HDAC6 siRNA进行细胞干预，在小鼠气管内灌注CB的不同时间点给予小鼠特异性HDAC6抑制剂（TSA），应用WB、RT-PCR、免疫组化、HE染色以及ELISA等方法，从整体动物、细胞和分子水平探讨HDAC6在CB诱导呼吸功能障碍性疾病中的分子机制。结果显示，与正常对照组相比，CB（≥12.5μg/ml）染毒细胞24h的细胞存活率和HDAC6 mRNA表达下降（P<0.05），12.5、25 μg/ml CB染毒组细胞内HDAC6蛋白表达升高（P<0.05），100 μg/ml CB染毒组细胞内IFT88蛋白表达降低，LC3-Ⅱ蛋白表达升高（P<0.05），CB（≥25μg/ml）染毒组IL-8、IL-6和TGF-β1表达均升高（P<0.05）；与HDAC6 siRNA预处理的正常16HBE细胞相比，25、50 μg/ml CB染毒组细胞内HDAC6 mRNA和蛋白表达降低，50 μg/ml CB染毒组细胞内IFT88 mRNA升高（P<0.05），IL-8、IL-6、TGF-β水平升高（P<0.05）。气管内灌注CB的小鼠，在染毒第1、7、28、56、84天肺组织内均存在较明显的炎症，且在第84天肺泡间隔变薄、断裂，相互融合成囊状，肺泡壁毛细血管数量减少，呈肺气肿改变；肺泡灌洗液和血清中IL-8表达升高（P<0.05），染毒组小鼠肺组织内HDAC6、IFT88、LC3-Ⅱ表达升高（P<0.05）；在染毒前给予TSA的小鼠肺组织炎症并未明显减轻，IL-8表达也未明显持续下降；但在染毒7天、28天给予TSA的肺组织在第56、84天炎症反应减轻，肺泡壁及肺泡间隔结构基本恢复完整，且小鼠肺组织内HDAC6蛋白表达均降低，而IFT88蛋白的表达升高，血清中IL-8的表达显著降低（P<0.05）。结果表明CB可通过HDAC6介导纤毛自噬通路诱导呼吸功能障碍相关疾病的发生，且特异性阻断HDAC6可在CB诱导的肺部炎症早期过程中具有较明显抑制炎症的作用。