EgMKK2的生物学功能及其在细粒棘球蚴生长发育中作用的研究

包虫病是新疆、青海等西部7省（区）高发的人畜共患病，95%由感染细粒棘球蚴（Eg）所致。与Eg生长发育及致病性密切相关的信号通路的研究少有报告。我们前期研究发现Eg存在MEK-ERK信号通路，包括关键成员EgMKK2（MEK1/2样MAPKK），且MEK1/2抑制剂（PD184352）有效降低Eg体外存活率，提示EgMKK2参与Eg生长发育的过程。但EgMKK2的生物学功能及其在Eg生长发育中的作用并未明确。本研究拟利用免疫荧光、酵母双杂交和底物活性等实验鉴定EgMKK2的表达、定位及生物学功能；其次体外培养Eg，采用正向激活（EGF刺激）和反向干预（MEK1/2抑制剂）的方法明确EgMKK2在Eg生长发育中的作用；最后以体内感染模式动物方式，确定EgMKK2干预前后对Eg致病性的影响。为针对以EgMKK2为中心，其通路上下游成员为靶点的药物研发、疫苗研制及临床治疗奠定基础和提供理论依据。

EgMKK2的生物学功能及其在细粒棘球蚴生长、发育和致病性中的作用不明。本研究克隆获得EgMKK2基因，生物信息学分析显示EgMKK2与哺乳动物MEK1/2高度同源，具有丝裂原活化蛋白激酶激酶（MEK）丝氨酸/苏氨酸激酶高度保守的催化域。在mRNA和蛋白水平检测表明EgMKK2在细粒棘球蚴原头蚴和囊泡阶段均存在表达，主要定位于原头蚴被膜、吸盘及顶突部位，其中原头蚴被膜和吸盘部位表达显著。酵母双杂交和免疫共沉淀结果显示EgMKK2与Eg14-3-3.2和下游EgERK之间存在相互作用，EgMKK2自身也能够形成同源二聚体，并且体外表达EgMKK2蛋白具有激酶活性，能够使底物髓磷脂碱性蛋白（myelin basic protein，MBP）发生磷酸化。体外实验表明三种抑制剂（Sorafenib、PD184352、U0126）均能有效抑制EgMKK和EgERK激酶的活性，对细粒棘球蚴原头蚴和囊泡均具有杀伤效果，其中Sorafenib杀伤效果较好；此外，宿主细胞因子EGF能够激活EgERK激酶的活性，对细粒棘球蚴原头蚴生长有一定的促进作用。体内实验结果表明，细粒棘球蚴原头蚴分别经三种抑制剂体外干预后，对小鼠的感染率明显降低，其中抑制剂Sorafenib和U0126干预效果较好，减轻了宿主肝脏的损伤。利用细粒棘球蚴感染小鼠模型，抑制剂Sorafenib和PD184352通过干预细粒棘球蚴MEK-ERK信号通路关键成员EgMKK和EgERK激酶的活性，破坏囊泡生发层的结构，对囊型包虫病小鼠模型有一定的治疗效果。本项目初步阐明EgMKK2的生物学功能及其在细粒棘球蚴生长发育中的作用；通过干预EgMKK2激酶的活性能够明显降低细粒棘球蚴对宿主的致病性，该激酶抑制剂对囊型包虫病有一定的治疗效果，从而为细粒棘球蚴MEK-ERK信号通路中关键成员为靶点的药物研发、疫苗研制以及临床治疗提供新的思路。针对宿主细胞因子EGF对细粒棘球蚴生长、发育和致病性的调控机制，以及抑制剂对囊型包虫病的疗效，包括用药浓度、疗程和副作用等相关指标的检测，还需进一步研究。