肿瘤细胞来源的诱导多能干细胞研究

诱导型多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells, iPS）是在体细胞中导入数个转录因子重编程得到的胚胎干细胞样产物。从2006年Yamanaka提出这个概念以来，许多种类体细胞在特定转录因子作用下被成功诱导为iPS。2010年来源于人类慢性髓性白血病癌细胞诱导成为iPS细胞，提示肿瘤细胞可以被重编程为正常的iPS细胞，但实体瘤细胞诱导为iPS的研究国内外尚处于初步阶段。本研究通过应用piggyBac转座子和四环素介导的基因表达系统，在实体瘤黑色素瘤细胞系B16-F10稳定表达四个转录因子（ Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4）诱导其成为iPS细胞，或成为独特的Tumor-iPS细胞，并进一步分析该诱导性多能干细胞的生物学特性及与肿瘤干细胞的异同，包括肿瘤的恶性程度、转移特性等。有助于深入认识肿瘤转移以及重编程机理，为肿瘤病人的靶向细胞治疗提供理论依据。

本研究中，我们以piggBac转座子为载体将转录因子Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc转入小鼠黑色素瘤细胞系B16-F10中，得到黑色素瘤来源的诱导多能性干细胞B16-TiPS。研究发现，B16-TiPS细胞高表达内源性多能性干细胞标记基因Oct4，Sox2，Nanog等；低表达黑色素细胞标记基因Tyr和Dct，且丧失分泌黑色素的能力。B16-TiPS在体外可分化为三胚层细胞，并且经骨系定向诱导分化后可以形成终末分化的骨细胞；小鼠体内成瘤实验证明，B16-TiPS可以形成低分化的畸胎瘤。重亚硫酸盐测序发现，细胞重编程重塑了黑色素瘤细胞表观遗传学状态，B16-TiPS中多能性干细胞标记基因Nanog和Oct4发生去甲基化。随后研究发现，B16-TiPS对肿瘤化疗药物5-FU和DTIC不敏感，化疗药物处理后细胞凋亡减少；但对诱导分化剂敏感。B16-TiPS细胞琼脂克隆形成能力、肿瘤侵袭和转移能力增加；且B16-TiPS高表达肿瘤干细胞（CSCs）的标记基因，形成肿瘤球能力大大提高。综上所述，我们得到的黑色素瘤来源的诱导多能性干细胞B16-TiPS并不是正常的iPS细胞，但具有一定干细胞特性，使得它的肿瘤形成能力、侵袭和转移能力与诱导前比更为增强，这与我们预期的临床治疗效果相违背，因此我们又继续探寻能够使肿瘤细胞B16-F10回归正常的新思路。既然不能将肿瘤细胞重编程去分化至正常iPS细胞，我们将重编程后B16-TiPS细胞诱导分化，从而逆转了它的生物学表型，提示重编程后的诱导分化疗法可能成为临床治疗恶性黑色素瘤的新方法。另据2008年PNAS文章报道，一种调控人体胚胎干细胞发育的蛋白质同时能抑制恶性黑色素瘤的生长与扩散，但其确切机制未完全明确，我们将黑色素瘤细胞B16-F10与C57小鼠胚胎干细胞（mESCs）混合培养，初步得到了mESCs能抑制B16-F10并可能诱导B16-F10凋亡的结论。这部分实验结果已在Cell学术研讨会上作海报展出，受到与会专家高度评价。对于mESCs诱导B16-F10凋亡的确切机制，将进一步深入研究。本研究成功建立起小鼠黑色素瘤来源的TiPS，深入分析其多能性和肿瘤相关生物学特性，为探讨细胞重编程过程在肿瘤发生发展中的作用提供了新的切入点，并且TiPS细胞为体外研究肿瘤发生发展的病理过程、肿瘤的药物筛选和临床治疗的研究提供新的细胞模型