假白榄烷型大环二萜类化合物抗非小细胞肺癌EGFR-TKIs获得性耐药的作用机制和构效关系研究

EGFR-TKIs have been proved good therapy in NSCLC, but acquired resistance limits its clinical use. It is hot point for R&D of EGFR-TKIs how to overcome acquired resistance. EGFR T790 mutant and Met amplification are main reasons that result in acquired resistance of EGFR-TKIs. Our previous studies proved that several new jatrophane diterpenes from Euphorbia sororia and Euphorbia turczaninowii showed marked inhibitory activities against NSCLC cell lines. The primary mechanism showed that jatrophane diterpenes overcome resistance of cancer cells by inhibiting phosphorylation of EGFR and c-Met. In the project,more jatrphane diterpenes from Euphorbia genus are to isolated and synthesized; Inhibitory activities against cancer cells are evaluated in vivo and in vitro; Pharmacological EGFR-TKIs-resistant mechanisms are determined; In addition,action sites and structure-activity relativity are presented on the basis of molecular docking and computer aided drug design. The results provide scientific facts for discovery of new leding compounds of NSCLC drugs.

获得性耐药问题严重制约了EGFR酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）在临床上治疗非小细胞肺癌（NSCLC）的广泛使用，EGFR T790M突变和Met基因扩增是导致其获得性耐药的重要机制。我们前期发现来源于大戟属植物的假白榄烷型大环二萜类成分对吉非替尼敏感和耐药NSCLC细胞以及小鼠移植瘤均具有显著的抑制活性，初步的作用机制研究表明其能够抑制耐药EGFR及c-Met蛋白的磷酸化。本项目拟进一步对3种大戟属植物中的假白榄烷型化合物进行分离、鉴定、富集和结构修饰，采用单独或联合用药评价其对多种敏感或耐药的NSCLC细胞和小鼠移植瘤的活性，利用western-blot等分子生物学技术探讨其抗耐药的作用靶点和作用机制，同时利用分子对接方法研究活性化合物与耐药靶蛋白之间的结合位点和构效关系。本研究将为EGFR-TKIs获得性耐药NSCLC新型治疗药物先导化合物的发现提供科学依据。

本研究从对叶大戟等药用植物中共分离鉴定了96个假白榄烷型化合物，合成了12个含不同脂肪链和芳香环的假白榄烷内酯化合物，其中15个为新化合物，2个为新骨架的杂萜类化合物；在研究了所有假白榄烷型化合物对吉非替尼敏感的HCC827细胞增殖抑制作用构效关系的基础上，发现化合物ES-201活性最好，且毒性较低；化合物ES-201能使HCC827细胞的凋亡率为76.5%，G1期比例为86.2%，亦可在10和100 nM时明显抑制EGFR的磷酸化；化合物ES-201对EGFR（T790M）耐药突变的H1975细胞和c-Met基因扩增的H1650细胞均显示出明显的抑制作用（IC50均小于10 nM）；10和100 nM化合物ES-201可明显抑制EGFR（T790M）和c-Met的磷酸化；动物实验结果表明，化合物ES-201（10 mg/kg）组对HCC827细胞和H1975细胞瘤重都显著低于对照组，吉非替尼（100 mg/kg）对于H1975细胞移植瘤未显示明显的抑制作用；化合物ES-201（0.1 μM、1.0 μM）能显著降低H1975细胞对吉非替尼的 IC50值，提高H1975细胞对吉非替尼的敏感性，其逆转倍数随着化合物ES-201浓度的增高而增加；HPLC检测耐药细胞内吉非替尼浓度变化的结果说明化合物ES-201能部分逆转H1975细胞对吉非替尼耐药，其逆转机制与增加吉非替尼浓度有关；分子生物学研究表明，化合物ES-201（0.1 μM组）联合吉非替尼（10 μM组）对H1975细胞EGFR、Akt mRNA显著降低；不同剂量化合物ES-201单药和化合物ES-201（0.1 μM）联合吉非替尼（10 μM），H1975细胞磷酸化的p-EGFR、p-Akt弱，说明化合物ES-201影响了H1975细胞的 PI3K/Akt信号通路，两药联合有协同效应；此外，研究还发现化合物ES-201与L858R药敏突变的EGFR蛋白作用位点亲和力高；综上，假白榄烷型大环二萜先导化合物ES-201的发现为NSCLC EGFR-TKIs获得性耐药新型治疗药物的研究提供科学依据。