环二鸟苷酸调控可德胶合成的分子机理

农杆菌ATCC31749菌株在氮素限制和低pH条件下，能高效合成用于食品和医药等领域的可德胶。该菌可德胶合成酶操纵子（crd）表达受转录因子crdR正调控。与多数胞外多糖相似，可德胶合成受环二鸟甘酸（c-di-GMP）的调节，但分子机制不清。我们拟用ATCC31749基因组序列，分析可德胶合成前体分子尿苷二磷酸葡萄糖合成基因、可德胶合成酶及运输等基因是否具c-di-GMP核糖开关和（或）相应编码蛋白有无c-di-GMP结合位点；异源表达c-di-GMP合成与降解酶基因改变胞内c-di-GMP含量后，可德胶合成过程关键基因表达；c-di-GMP对crdR和crd操纵子表达及对相应蛋白crdR、crdA、crdS和crdC活性调节等研究，来揭示c-di-GMP对可德胶合成关键节点的调控机制。本研究将探明c-di-GMP调控可德胶合成机理，为优化发酵工艺及更高产的工程菌株的构建等提供理论基础。

ATCC31749 菌株能高效合成可德胶（curdlan）。我们用SMRT测序并组装成含1环状，１线性染色体和两个质粒的基因组完成图。可德胶合成受环二鸟甘酸（c-di-GMP）的调控，分析确定该菌c-di-GMP合成和降解的二鸟苷酸环化酶（DGC）和磷酸二酯酶（PDE）各26和9个， 140个基因参与多糖的合成相关，并对可德胶合成基因进行染色体定位。表达yddV（AgyddV）和yhjH (AgyddV）菌株指数期与对照（AgPBQ）相比， c-di-GMP增加和降低，但稳定期差异不大；AgyddV生物量低，产可德胶高，而AgyhjH生物量和产胶不变，而转基因菌株其他多糖合成减弱或不变，于对数生长期(E)和稳定生长期(S)，提取RNA进行转录组测序，结果是AgPBQ(E)与AgPBQ(S)相比，下调基因主要负责细胞的生长与初生代谢；上调基因主要富集到低氮耐受，物质转运，多糖合成和逆境相应等。其中可德胶合成相关基因crdR， crdA, crdS和crdC， UDPG合成酶，c-di-GMP代谢基因2_1588等上调表达。与AgPBQ相比，AgyddV中 crdS和crdC，c-di-GMP合成酶（1-1399，1-1699），葡萄糖激酶（3-323）等上调表达，且抗逆相关基因上调，促生长基因下调表达。与AgPBQ相比，AghjH，琥珀酰葡聚糖（succinoglycan）合成和在蛋白质合成相关的核糖核蛋白基因上调表达，而c-di-GMP合成基因（2_777，2_768）则下调表达。分析发现多个DGS在可德胶合成期上调表达，其中2-1588，表达差异大，含信号肽，具跨膜结构，氧感应，GGDEF和EAL等结构域，构建其敲出和表达表达载体。出研究发现2-1588敲出降低了可德胶的合成。表达并纯化crdR,crdA,crdS和crdC等蛋白，发现除crdS外，均与c-di-GM无明显的结合作用，表达并纯化与PilZ结构域同源的crdS的C末端，初步发现其能经与c-di-GMP相结合。研究确定ATCC31749菌株在稳定生长阶段DGC上调表达，促进c-di-GMP的积累，进而促进转录，促进可德胶合成酶活性来促进可德胶的合成。